高效液相色譜法測定酚酞片中的7個(gè)雜質(zhì)

聶忠莉， 趙樹敏， 王曉玲， 趙玉玲， 張 勇， 蕭茂玲(.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 6006； .成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司， 四川 成都 6004)

0 引 言

酚酞片主要成分是酚酞[1]，臨床上常用于治療習(xí)慣性頑固性便秘.酚酞為刺激性傾瀉性，主要作用于大腸，口服后在腸道堿性環(huán)境中形成可溶性鈉鹽，刺激腸壁內(nèi)神經(jīng)叢，直接作用于腸道平滑肌，使腸蠕動(dòng)增加.同時(shí)酚酞又抑制腸道內(nèi)水分的吸收，使水和電解質(zhì)在結(jié)腸蓄積，產(chǎn)生緩瀉作用，其作用與腸中堿性大小有關(guān)，且其作用溫和，很少引起腸道痙攣[2].

酚酞的制作主要由鄰苯二甲酸酐和苯酚反應(yīng)合成.相關(guān)研究表明，酚酞在合成過程中，未完全反應(yīng)的起始原料、反應(yīng)的中間體、反應(yīng)副產(chǎn)物和分解產(chǎn)物以及參與反應(yīng)的試劑可能引入雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)H、雜質(zhì)I及雜質(zhì)J 10種雜質(zhì)，分別為鄰苯二甲酸酐、苯酚、熒光母素、2-羥基蒽醌、2-(4-羥基苯甲酰)苯甲酸、1-羥基蒽醌、酚酞啉、鄰苯二甲酸、芴和苯酞[3].《中國藥典》2015年版二部[4]收載酚酞片的雜質(zhì)檢查項(xiàng)是采用薄層色譜法控制熒光母素的限度[5-6].本實(shí)驗(yàn)是采用高效液相色譜法對酚酞片中可能存在的7個(gè)已知雜質(zhì)(包括雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I)含量進(jìn)行控制研究，結(jié)果表明該方法具有合理性和有效性.

1 材料與儀器

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)所用材料包括：鄰苯二甲酸酐(雜質(zhì)A)(批號，906637-LJC0Q81，含量為99.79%)、芴(雜質(zhì)I)(批號，334723-L8809，含量為98%)，購自北京百靈威科技有限公司；熒光母素(雜質(zhì)C)(批號，100075-201303,含量為100%)，購自中國食品藥品檢定研究院；2-(4-羥基苯甲酰)苯甲酸(雜質(zhì)E)(批號，F(xiàn)CC17197，含量為98.97%)、1-羥基蒽醌(雜質(zhì)F)(批號，F(xiàn)CB044533，含量為95%)，購自英國Fluorochem公司；2-羥基蒽醌(雜質(zhì)D)(批號，IBQBD-FAH1012,含量為97.4%)、酚酞啉(雜質(zhì)G)(批號，18095-LVSKC-CB,含量為99.1%)，購自東京化成工業(yè)株式會(huì)社；酚酞片(批號，20170904、170802、180501、180502、180503，規(guī)格為50 mg/0.1 g)，購自四川省通園制藥有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水.

1.2 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：1410高效液相色譜儀(日立(中國)有限公司)，BP-210D型精密電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，756CRT型紫外分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)，Kelisonic超聲清洗儀(深圳市科力超聲波洗凈設(shè)備有限公司).

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 各雜質(zhì)貯備液的制備.

精密稱取雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I對照品適量，于100 mL容量瓶中加乙腈溶解并稀釋至刻度，制成1 mL中含各雜質(zhì)0.5 mg的乙腈溶液，作為各雜質(zhì)貯備液.

2.1.2 定位溶液.

取各雜質(zhì)貯備液200 μL加乙腈稀釋至1 mL作為定位溶液.

2.2 色譜條件

實(shí)驗(yàn)的色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以0.01 mol/L磷酸氫二甲溶液的0.1%醋酸水溶液—乙腈(90∶10)為流動(dòng)相A，0.01mol/L磷酸氫二甲溶液的0.1%醋酸水溶液—乙腈(30∶70)為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫條件[7]見表1；檢測波長為270 nm，柱溫40 ℃，流速1.0 mL/min.

表1 洗脫條件表

2.3 系統(tǒng)適用性

精密稱取酚酞片(批號，20170904)細(xì)粉約11.23 mg，置10 mL的量瓶中，再另取“2.1”項(xiàng)下雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I貯備液各40 μL同置上述10 mL量瓶中，加乙腈至刻度，搖勻，即為系統(tǒng)適用性溶液.精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖如圖1所示.

圖1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)色譜圖

由圖1可知，雜質(zhì)E、雜質(zhì)A、雜質(zhì)G、酚酞、雜質(zhì)D、雜質(zhì)F、雜質(zhì)C及雜質(zhì)I依次出峰，主峰及各雜質(zhì)峰保留時(shí)間的RSD均小于1.0%，峰面積的RSD小于2.0%，雜質(zhì)峰之間的分離度均遠(yuǎn)大于1.5，拖尾因子也在較好范圍內(nèi)，表明本方法系統(tǒng)適用性好，可進(jìn)一步進(jìn)行研究.

2.4 酚酞片提取條件的選擇

精密稱取酚酞片(批號，170802)細(xì)粉約15 mg，共3份，分別置于10 mL量瓶中，加乙腈適量，分別超聲處理1、2、5 min，放冷后定容.各取2 mL離心(轉(zhuǎn)速為10 000 r/min)10 min，得上清液，另取2 mL用0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，得續(xù)濾液，精密量取上清液、續(xù)濾液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖.結(jié)果表明，6種提取方法的結(jié)果基本一致，故任選一種作為酚酞片提取處理的方法，即超聲處理1 min后，再離心(轉(zhuǎn)速為10 000 r/min)10 min，得上清液，作為本片測定的供試品溶液.

2.5 定量限、檢測限

取“2.1”項(xiàng)下各雜質(zhì)貯備液，分別加乙腈稀釋至系列濃度的供試品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件，分別精密量取20 μL進(jìn)行測定，計(jì)算當(dāng)各雜質(zhì)響應(yīng)值約為基線噪音的3倍和10倍時(shí)的進(jìn)樣量，結(jié)果計(jì)算出，雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I的定量限分別為25.194 ng、9.881 ng、0.721 ng、6.899 ng、3.863 ng、11.989 ng、5.433 ng；檢測限分別為8.755 ng、2.430 ng、0.201 ng、3.265 ng、1.157 ng、3.965 ng、2.979 ng.

取相當(dāng)于定量限濃度的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察其重現(xiàn)性.結(jié)果表明，各峰保留時(shí)間RSD值均小于0.1%，峰面積RSD值均小于5.0%，表明重現(xiàn)性較好.

2.6 專屬性

取酚酞片細(xì)粉(批號，170802)，分別進(jìn)行高溫、氧化、酸、堿及光照破壞實(shí)驗(yàn)，考察各雜質(zhì)的降解情況.結(jié)果表明，空白溶劑無干擾；破壞產(chǎn)生的雜質(zhì)與主峰，以及雜質(zhì)與雜質(zhì)之間分離度均在1.5以上，能達(dá)到完全分離，主峰峰純度均達(dá)到0.999，雜質(zhì)峰峰純度基本均達(dá)0.99以上；各破壞樣品的物料平衡均在98%～117%之間.實(shí)驗(yàn)表明，該方法專屬性良好，能檢測出本品在儲(chǔ)藏和運(yùn)輸過程的極端條件下產(chǎn)生的降解產(chǎn)物.

2.7 線性關(guān)系

取“2.1”項(xiàng)下各雜質(zhì)貯備液用乙腈逐級稀釋得到系列雜質(zhì)溶液，考察其濃度與峰面積的線性關(guān)系.結(jié)果表明，在1 μg/mL～23 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，各雜質(zhì)峰面積與樣品濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999.

2.8 回收率

分別精密稱取酚酞片(批號，170802)細(xì)粉約15 mg，共10份，其中1份置10 mL量瓶中，加乙腈適量，超聲1 min，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，離心(轉(zhuǎn)速為10 000 r/min)10 min后，得上清液，作為供試品空白溶液.另9份分別分成3組，分別加入“2.1”項(xiàng)下各雜質(zhì)貯備液20 μL、40 μL、60 μL，每組3份，加乙腈適量，超聲1 min，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，離心(轉(zhuǎn)速為10 000 r/min)10 min后，得上清液，分別作為回收率50%、100%、150%的供試品溶液.分別精密量取20 μL，注入液相色譜儀.另精密量取“2.1”項(xiàng)下各雜質(zhì)貯備液0.8 mL于200 mL容量瓶中，加乙腈至刻度稀釋成1 mL中含各雜質(zhì)2 μg的溶液，作為對照品溶液，同法測定.計(jì)算供試品溶液中各雜質(zhì)的含量，并扣除酚酞中各雜質(zhì)的含量，計(jì)算回收率.結(jié)果表明，雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I 7個(gè)雜質(zhì)的平均回收率分別為101.94%、103.02%、101.63%、100.87%、100.98%、99.11%、101.67%，RSD值分別為1.47%、2.31%、1.76%、1.06%、1.15%、0.74%、1.38%，表明了在該條件下，各雜質(zhì)的回收率良好，準(zhǔn)確度高.

2.9 重復(fù)性

精密稱取酚酞片(批號，170802)細(xì)粉6份，每份約15 mg，置10 mL量瓶中，分別精密加入“2.1”項(xiàng)下各雜質(zhì)貯備液40 μL，加乙腈適量，超聲1 min，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，離心(轉(zhuǎn)速為10 000 r/min)10 min后，得上清液，作為供試品溶液.分別精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖.另精密量取“2.1”項(xiàng)下各雜質(zhì)貯備液0.8 mL，加乙腈稀釋成1 mL中含各雜質(zhì)2 μg的溶液，作為對照品溶液，同法測定.計(jì)算6份樣品中各雜質(zhì)的含量，并計(jì)算RSD.結(jié)果表明，雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I 7個(gè)雜質(zhì)的RSD值分別為3.81%、1.57%、1.38%、1.57%、1.96%、1.51%、3.81%，表明本方法的重復(fù)性好.

2.10 中間精密度

由不同分析人員在不同時(shí)間，采用不同儀器對同一批樣品的6份供試品溶液進(jìn)行測定.結(jié)果表明，雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I 7個(gè)雜質(zhì)的RSD值分別為4.16%、4.90%、4.95%、1.75%、1.84%、4.78%、3.85%，表明中間精密度良好.

2.11 穩(wěn)定性

以回收率項(xiàng)下的100%-1#溶液，作為供試品溶液.分別在0、13、17、36 h注入液相色譜儀，記錄不同時(shí)刻樣品中各雜質(zhì)的峰面積，并計(jì)算RSD.結(jié)果表明，雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I 7個(gè)雜質(zhì)的RSD值分別為0.76%、1.29%、1.13%、1.03%、1.32%、2.32%、1.30%，表明了在36 h內(nèi)溶液的穩(wěn)定性良好.

2.12 耐用性

精密稱取酚酞片(批號，170802)細(xì)粉約15 mg，置10 mL量瓶中，分別精密加入“2.1”項(xiàng)下各雜質(zhì)貯備液40 μL，加乙腈適量，超聲1 min，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，離心(轉(zhuǎn)速為10 000 r/min)10 min后，得上清液，作為供試品溶液.量取“2.1”項(xiàng)下各雜質(zhì)貯備液40 μL，用乙腈溶解稀釋至10 mL作為對照品溶液.分別精密量取上述溶液各20 μL，在柱溫、流速、色譜柱及檢測波長等進(jìn)行微小變動(dòng)的條件下，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算各雜質(zhì)的含量，并計(jì)算RSD.結(jié)果表明，雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I 7個(gè)雜質(zhì)的RSD值分別為4.21%、4.90%、4.81%、2.90%、2.72%、4.83%、3.87%，表明本方法耐用性良好.

2.13 樣品測定

取酚酞片細(xì)粉約15 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加乙腈適量，超聲1 min，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，離心(轉(zhuǎn)速為10 000 r/min)10 min后，得上清液，作為供試品溶液.另取各雜質(zhì)雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I適量，加乙腈制成1 mL各含雜質(zhì)2 μg混合溶液作為對照品溶液.分別精密量取上述各溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖.供試品溶液色譜圖中如有與對照品溶液色譜圖中雜質(zhì)峰保留時(shí)間一致的峰，按外標(biāo)法計(jì)算各雜質(zhì)的含量，含各雜質(zhì)應(yīng)不得過0.1%.各批樣品檢測結(jié)果見表2.

表2 各批樣品檢測結(jié)果

由表2可知，2個(gè)規(guī)格共6批樣品均只檢出有關(guān)雜質(zhì)C,且雜質(zhì)C的含量均小于0.1%，均未檢出其他有關(guān)雜質(zhì)和未知雜質(zhì)，因此2個(gè)規(guī)格共6批樣品結(jié)果符合規(guī)定.

3 討 論

本研究采用可見—紫外分光光度計(jì)，在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，對各雜質(zhì)的吸收波長進(jìn)行了考察.結(jié)果表明，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)H、雜質(zhì)I及雜質(zhì)J在220 nm、250 nm、270 nm波長處均有吸收，綜合各雜質(zhì)看，每個(gè)雜質(zhì)在270 nm波長處有最大吸收，所以將各雜質(zhì)的測定波長擬定在270 nm波長處.

由于雜質(zhì)D、雜質(zhì)F及雜質(zhì)I在各批樣品中均未檢出，在穩(wěn)定性考察過程中也未見增加趨勢，所以僅作研究，未收載入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).雜質(zhì)C在各批樣品中均可檢出，雜質(zhì)A、雜質(zhì)E及雜質(zhì)G在堿破壞條件下均有產(chǎn)生，所以將雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E和雜質(zhì)G收載入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，限度為不得過0.1%.

本研究通過對雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I測定方法進(jìn)行了方法學(xué)研究，其專屬性、定位試驗(yàn)、系統(tǒng)適用性、定量限、檢測限、回收率、重復(fù)性、中間精密度、穩(wěn)定性及耐用性均達(dá)到良好的效果，表明所采用的分析方法是科學(xué)的、合理的，并能有效控制酚酞片中各雜質(zhì)的含量.《中國藥典》2015年版二部收載的酚酞片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，僅對熒光母素(雜質(zhì)C)的含量進(jìn)行限度控制，采用的是薄層色譜法，而本研究中采用高效液相色譜法對雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)I進(jìn)行含量控制，該測定方法優(yōu)于現(xiàn)行藥典中給出的相關(guān)檢測方法.