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    應用Time-lapse研究人3PN胚胎的卵裂模式

    2019-10-16 01:19:08史艷彬馬超余巧巧邵小光
    生殖醫(yī)學雜志 2019年10期
    關鍵詞:紡錘體合子卵裂

    史艷彬,馬超,余巧巧,邵小光

    (大連市婦女兒童醫(yī)療中心生殖與遺傳醫(yī)學中心,大連 116000)

    受精卵含有三個原核稱為3PN(tripronuclear)合子。3PN在體外受精(IVF)胚胎中的發(fā)生率是4%~7%,卵胞漿內單精子注射(ICSI)胚胎中的發(fā)生率是6%[1]。IVF過程中的3PN胚胎中,80%以上是因為雙精入卵導致;而ICSI過程中的3PN胚胎主要是卵母細胞第二次減數分裂失敗或第二極體未能排出導致[2]。

    以往關于3PN的研究主要集中在染色體[3],而不是細胞周期的時間動力學。研究發(fā)現,在80%以上的IVF 3PN胚胎中可以觀察到兩對中心粒,而ICSI 3PN胚胎中僅發(fā)現一對中心粒[4]。因為第一次有絲分裂被父源性中心??刂?,我們推測IVF 3PN與ICSI 3PN、ICSI 2PN和IVF 2PN的卵裂模式可能存在差別。3PN胚胎的形態(tài)學表現與2PN胚胎相同,所以IVF周期中原核過早消失的胚胎因無法明確PN數往往被丟棄。本文通過時差胚胎監(jiān)測(Time-lapse)培養(yǎng)箱,比較IVF 3PN與ICSI 3PN、ICSI 2PN和IVF 2PN的卵裂模式和胚胎動力學參數,為避免錯誤地丟棄具有發(fā)育潛能的胚胎提供理論依據。

    資料與方法

    一、研究對象

    回顧性分析2017年7月至2018年6月就診于大連市婦女兒童醫(yī)療中心的生殖與遺傳醫(yī)學中心接受輔助生殖技術(ART)助孕并同意將胚胎放置Time-lapse培養(yǎng)箱中培養(yǎng)監(jiān)測的患者142例。

    納入標準:2PN組胚胎來源于受精卵全部是2PN(本周期沒有3PN、1PN、0PN)的患者,3PN組胚胎來源于受精卵至少有一個3PN的患者;年齡≤38周歲;ART次數<3次。排除標準:卵巢功能儲備下降;FSH>20 U/L;子宮內膜異位癥;PCOS患者;男方嚴重少弱畸精子癥;補救顯微受精患者。排除未分裂合子、5細胞以下和碎片>20%的胚胎。

    二、研究方法

    1.分組:根據受精方式及受精結果分為4組:IVF 2PN組(n=150)、ICSI 2PN組(n=100)、IVF 3PN組(n=132)、ICSI 3PN組(n=11)。

    2.IVF和胚胎培養(yǎng):常規(guī)超促排卵、陰道經B超引導下采卵、獲得的卵冠丘復合物在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~6 h后,依據治療指征給予IVF或ICSI受精。ICSI受精后立即放置Time-lapse三氣培養(yǎng)箱中(ESCO Miri-TL,丹麥)連續(xù)培養(yǎng);IVF精卵共培養(yǎng)置于三氣培養(yǎng)箱中(Labotect C200,德國),短時受精推測受精后放置Time-lapse三氣培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。所有胚胎使用一步培養(yǎng)液(global total LP,美國)培養(yǎng),2PN胚胎培養(yǎng)至D3天移植或冷凍,3PN胚胎培養(yǎng)至八細胞以上。

    3.Time-lapse監(jiān)測和評估:平均每10 min圖像被記錄一次。對于ICSI胚胎,精子注入卵母細胞的時間定義為t0;對于IVF胚胎,卵母細胞加入調好濃度的精液盤中的時間定義為t0。所有關鍵時間點和分裂模式在Time-lapse軟件系統(tǒng)下被同一觀察者定義。記錄卵裂模式、原核出現的時間、原核消失的時間、第一次卵裂的時間、t4(從1-細胞分裂成4-細胞的時間)、t3-t5(從3-細胞分裂成5-細胞的時間)。

    三、統(tǒng)計學處理

    結果

    一、各組胚胎卵裂模式比較

    IVF 3PN胚胎組79.55%(105/132)直接分裂成4-細胞,18.94%(25/132)直接分裂成3-細胞,0.76%(1/132)直接分裂成5-細胞,0.77%(1/132)直接分裂成6-細胞;IVF 2PN、ICSI 3PN、ICSI 2PN胚胎組異常分裂模式主要為直接分裂成3-細胞。

    統(tǒng)計結果顯示:IVF 3PN胚胎分裂成2-細胞比率顯著低于其余3組(P<0.001),IVF 3PN胚胎直接分裂成4-細胞的比例顯著高于其余3組(P<0.001);而IVF 3PN和IVF 2PN胚胎、ICSI 3PN、ICSI 2PN胚胎直接分裂成3-細胞比率無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

    二、IVF 3PN胚胎與IVF 2PN、ICSI 3PN、ICSI 2PN胚胎卵裂異常比率比較

    IVF 3PN胚胎第一次卵裂模式異常率、在28 h發(fā)育到4-細胞的比率以及t3-t5<11 h的胚胎比率均顯著高于其余3組(P<0.001);而IVF 3PN胚胎在23 h發(fā)生第一次卵裂的比率顯著低于其余3組(P<0.001)(表2)。

    三、各組胚胎動力學參數比較

    IVF 3PN胚胎原核消失的時間、第一次卵裂時間均顯著長于其余3組(P<0.05); IVF 3PN胚胎分裂成4-細胞的時間(t4)及從3-細胞到5-細胞(t3-t5)的時間均顯著短于其余3組(P<0.05);IVF 2PN、ICSI 3PN和ICSI 2PN之間的卵裂動力參數均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

    表1 IVF 3PN胚胎與IVF 2PN、ICSI 3PN、ICSI 2PN胚胎卵裂模式比較[n(%)]

    注:與IVF 3PN組比較,*P<0.001

    表2 IVF 3PN胚胎與IVF 2PN、ICSI 3PN、ICSI 2PN胚胎卵裂異常率比較[n(%)]

    注:與IVF 3PN組比較,*P<0.001

    表3 各組胚胎的動力學參數比較(-±s)

    注:與IVF 3PN組比較,*P<0.05

    討論

    部分研究者通過第2天觀察IVF 3PN合子有絲分裂的過程發(fā)現了部分合子直接分裂成3-細胞的現象。Kola等[5]報道了29個IVF 3PN合子中,18個(62%)直接分裂成3-細胞;Balakier[6]報道了32個IVF 3PN合子中,6個(19%)直接分裂成3-細胞;Pang等[7]報道了32個IVF 3PN合子中,7個(22%)直接分裂成3-細胞。然而,這些報道都是傳統(tǒng)的非連續(xù)性的胚胎評估。Staessen等[8]報道了ICSI 3PN合子有絲分裂的過程發(fā)現:第2天胚胎處于2-細胞或4-細胞階段,研究還比較了IVF和ICSI 3PN在第2天的細胞數,發(fā)現二者沒有統(tǒng)計學差異。與既往研究的胚胎培養(yǎng)方式不同,我們使用Time-lapse培養(yǎng)箱發(fā)現IVF 3PN中的79.55%(105/132)直接分裂成4-細胞,18.94%(25/132)直接分裂成3-細胞,0.76%(1/132)直接分裂成5-細胞,0.76%(1/132)直接分裂成6-細胞。我們也觀察到IVF 3PN分裂成3-細胞比率略高于ICSI 3PN,但無統(tǒng)計學差異(18.94% vs.18.18%,P=0.95)。

    中心粒和其周圍的基質組成了有絲分裂的紡錘體。1994年,Palermo等[9]研究證明精子的中心粒控制著合子的第1次有絲分裂。二精入卵可能會在合子中形成兩對中心粒,如果合子中過度的中心粒不休眠,那么過度的中心粒就有可能使合子卵裂異常:直接分裂成3-細胞[10]。因此,我們推測這就是IVF 3PN直接卵裂成3-細胞以上的發(fā)生率要顯著高于IVF 2PN、ICSI 2PN和ICSI 3PN的原因。但是在Time-lapse下不能直接觀察到中心粒和紡錘體結構,因此不能得到最終的結論。

    然而,多余的父源性中心粒影響卵裂的假說卻不能解釋部分正常2PN和部分ICSI 3PN也可能直接卵裂成3-細胞。 推測可能是卵孤雌激活會形成一個沒有中心粒的紡錘體極,再與一個正常的中心粒結合就可能形成第3個紡錘體[11];也有可能是父源性中心粒在第1個細胞周期的S期發(fā)生加倍復制,或者精子中攜帶兩對中心粒[12-13]。目前已經有研究發(fā)現2PN胚胎直接卵裂成3-細胞的植入率顯著低于正常卵裂模式的胚胎[14]。第3個紡錘體極形成的原因以及如何形成的將有待于進一步研究。

    我們還發(fā)現IVF 3PN第1個細胞周期顯著長于IVF 2PN[(27.06±1.59)h vs.(22.64±1.38)h](P=0.04)。推測可能是相比2PN胚胎,3PN胚胎的有絲分裂紡錘體結構更復雜。因為紡錘體的三級結構,有絲分裂的微管可能在3個位點連接在著絲粒,從而形成異常的“Y”字形赤道板,使得3PN胚胎需要更長的時間發(fā)生卵裂。本研究中,盡管ICSI 3PN直接分裂成3-細胞的比例高于ICSI 2PN(18.18% vs.11.00%,P=0.09),但是ICSI 3PN第1次卵裂的時間與ICSI 2PN相比無統(tǒng)計學差異[(22.32±1.56)h vs.(22.78±1.66)h](P=0.82)。雖然我們的研究數量有限,但是可以推測IVF 3PN與ICSI 3PN異常卵裂的原因不同。ICSI 3PN直接卵裂成3-細胞可能是合子先直接分裂成2-細胞,其中1個卵裂球沒有發(fā)生DNA和中心粒的復制就迅速發(fā)生分裂,并沒有形成耗時的“Y”字形赤道板。

    受顯微鏡技術發(fā)展的限制,3PN胚胎的發(fā)生機制還不清楚:是由于皮質反應缺陷導致雙精入卵,還是卵源性/精源性減數分裂錯誤導致雙雌受精/雙雄受精?國外學者新開發(fā)的顯微鏡技術——激光層片掃描顯微技術(Light sheet Microscopy technology,LSMT)[15],依賴其高速和空間精度大大減少了胚胎接觸的光毒性和光漂白性,并且具有非常高的時間分辨率的特性能夠對胚胎發(fā)育早期階段進行實時、3D成像。期待應用該技術可以早日揭示3PN胚胎的發(fā)生和異常卵裂的機制。

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