基因成品分裝與QC酶切檢驗生產(chǎn)工藝及分析

劉媛

【摘? 要】介紹了在基因部里的每個小組送來的質(zhì)粒送到我們的基因公共服務(wù)部，首先通過基因公共服務(wù)部里面要經(jīng)過基因成品分裝的測值、分裝、裝袋、提交的幾個步驟，然后在通過提交的在進行QC酶切驗證規(guī)范進行檢測，一般只有通過QC的檢測，才能將基因成品分裝，重點敘述的是分裝和QC檢測的工藝流程、操作規(guī)程、注意的問題及事故處理，提出了在基因成品分裝分裝和QC酶切驗證規(guī)范里面最重要的兩個步驟是分裝和酶切，這兩個結(jié)果會直接影響產(chǎn)品能否滿足所訂單用戶的要求。

【關(guān)鍵詞】分裝;裝袋;酶切;QC檢測

【中圖分類號】R197???? ?【文獻標(biāo)識碼】A????? 【文章編號】1672-3783（2019）03-0279-02

引言

介紹由各個小組送到QC的質(zhì)粒，先通過基因成品分裝的順序在由基因成品分裝提交至QC的檢測表，在進行后續(xù)的行程。

首先介紹一下分裝的整體的流程：第一是先用Nandro分光光度計進行測值，在測的值中，必須保證質(zhì)粒的濃度保持在80才可以進行分裝，分裝的一般分為4組和10組，偶爾會有20組的，分裝時一般分兩組，一個給訂單用戶，一個給QC進行檢測是否通過可發(fā)，發(fā)出去的必須要放進旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行凍干，也有訂單用戶要求液體基因成品分裝液體基因成品分裝的也需要讓所分的濃度保持在95到105的區(qū)間內(nèi);第二裝袋;第三提交QC清單。

1 基因成品分裝和QC酶切驗證規(guī)范的生產(chǎn)狀況

1.1質(zhì)粒是什么

細菌、放線菌和真菌中;自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄;拷貝數(shù)恒定;表達遺傳信息^[1]

1.1.3質(zhì)粒的作用

使宿主具有一些額外的特性，如對抗生素的抗性等^[2]。

1.2基因成品分裝的流程

1.2.1質(zhì)粒定量

測值：把每個組發(fā)下來的質(zhì)粒在分光光度計上面測值，濃度小于80的要放進旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，等到濃度到達80時我們才能進行分裝。

遇到超出OD值范圍，或提供質(zhì)粒量過少的質(zhì)粒，將其取出放到相應(yīng)小組的質(zhì)粒暫時存放區(qū)。發(fā)貨工作結(jié)束后，統(tǒng)計上述發(fā)貨不能通過的質(zhì)粒，并伴隨郵件歸還相對應(yīng)小組。

貼標(biāo)簽：將定量之后的質(zhì)粒擺放整齊，并按照DNA量的要求擺放上相應(yīng)數(shù)量的滅菌發(fā)貨管。DNA量的要求4微克的拜訪兩個滅菌發(fā)貨管;標(biāo)簽整潔的貼在發(fā)貨管壁上（標(biāo)簽與管壁之間沒有雜質(zhì)和手?。?，貼過之后要首位對齊。

定量流程：

（1）接通Nanodrop2000電源，并關(guān)閉上臂。

（2）打開Nanodrop2000操作軟件，選擇Nucleic Acid項。

（3）調(diào)零：吸取2微升TE加到下臂小孔上，放下上臂，按下軟件中的blank鍵。

（4）測量：用擦鏡紙擦去上下臂的TE，吸取待測樣品2微升，加至下臂測量孔上，放下上臂，按下軟件中的Measure鍵，保存測試結(jié)果至本機合適目錄。測量后，用擦鏡紙擦拭上下臂2～3次，繼續(xù)下一個樣的測量。

（5）測量大量樣品時，因每測60各左右，重新調(diào)零1次或者每一個小時重新調(diào)零一次。測量完畢后，因吸取ddH2O滴加到測量孔上，放下上臂，輕壓幾下，用擦鏡紙擦去上下臂的液體。

1.2.2質(zhì)粒分裝

首先是貼完標(biāo)簽之后，仔細核對標(biāo)簽和質(zhì)粒的一一對應(yīng)關(guān)系，確保對應(yīng)準確無誤后，進行分裝。按照多于DNA量要求的標(biāo)準進行分裝（以DNA量要求4微克，應(yīng)分裝質(zhì)粒大于等于4.5微克）質(zhì)粒逐個分裝到對應(yīng)的發(fā)貨管中。一般情況下，同樣的標(biāo)簽要求的發(fā)貨管中分裝的質(zhì)粒量相同。

將分裝對應(yīng)的質(zhì)粒發(fā)貨管，經(jīng)過再一次仔細的核對其標(biāo)簽之后，按照順序抽取一管質(zhì)粒，按照PUC系列紅蓋子和非PUC系列藍蓋子的原則對發(fā)貨管封口。與信息表核對信息提交發(fā)貨清單給QC組進行檢測。

在對質(zhì)粒進行分裝時，如果是分在4組的話，用6000除以濃度;如果是分在10 組的話，用11000除以濃度;如果是分20組的話，用22000除以濃度。

1.2.3質(zhì)粒送檢、凍干和裝袋

將分裝有相應(yīng)質(zhì)粒發(fā)貨管，經(jīng)過再一次仔細的核對其標(biāo)簽之后，按照順序分別抽取一管質(zhì)粒，按照PUC系列紅蓋子和非PUC系列藍蓋子的原則對應(yīng)發(fā)貨管封口，信息表核對信息，進行檢測。

裝袋：從旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中有序的取出質(zhì)粒已經(jīng)凍干的發(fā)貨管，擺放到相應(yīng)的位置;按照PUC系列紅蓋子和非PUC系列藍蓋子的原則對發(fā)貨管封口;在燈光下仔細檢查發(fā)貨管中的質(zhì)粒是否有含雜質(zhì);把發(fā)貨管放到相對應(yīng)的發(fā)貨袋中，與信息表核對信息，有的要裝穿刺，有的要裝甘油，有的要裝誘導(dǎo)劑。

1.3 QC酶切驗證規(guī)范的流程

1.3.1抽質(zhì)粒

由基因成品分裝提交的清單進行抽取質(zhì)粒已加TE的備份，在放水，水分為白水和藍水（配水：{白水：拿1750微升的無菌水加入200微升CUTSMART.藍水：拿1750微升的無菌水加入200微升和10乘140微升}拿到震蕩儀震蕩），對照每個質(zhì)粒的載體大小和片段大小選不同水和加入什么酶進行酶切^{[5] [6] [7]}。對照檢測表，偶爾會有SmalI驗證^{[8] [9]}。

1.3.2酶切

在所選取的水中，首先加入質(zhì)粒3微升（若是原始質(zhì)粒并且濃度在100納克/微升，加3微升;若濃度在200納克/微升，加2微升;若濃度在300納克/微升以上，加1微升），在對應(yīng)清單加入相應(yīng)的酶，酶的量是0.8微升。配好酶切體系，混勻（用手指輕彈幾下，用離心機離心一下），37度水浴半小時，在檢測表上記錄酶切反應(yīng)開始時間，及左右酶和編號，同時簽名。

根據(jù)檢測表上的要求，使用對應(yīng)的酶來進行酶切實驗：

質(zhì)粒的量需要根據(jù)載體片段大小適當(dāng)調(diào)整。

1.3.3點樣

在點樣之前都要做膠（做膠的方法是稱取1.62克的瓊脂糖，加入185毫升的TAE溶解，放入微波爐中高火加熱20分鐘，在10分鐘，8分鐘，6分鐘，4分鐘，2分鐘，拿出來的時候都要進行震蕩^[10]，最后倒入模具成型）。

1.3.4電泳

（1）上樣量：質(zhì)粒3微升，酶切產(chǎn)物6微升，Marker3微升。

（2）上樣順序：從左至右，質(zhì)粒、酶切產(chǎn)物、Marker。如果有PCR產(chǎn)物，點樣順序為質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物、酶切產(chǎn)物、Marker。

1.3.5拍膠

在前面一個步驟做完，也就是跑完膠，就要來拍膠了。

有3000Marker的就要先拍，在拍完3000后再放進電泳槽里面繼續(xù)跑KB，一般分3000則是在膠的三分之二出可拍，KB則是在膠的靠近邊緣的時候拍。如圖：

2 生物科技主要生產(chǎn)工藝的方法實驗步驟

2.1 反應(yīng)的機理

基因合成及相關(guān)分子生學(xué)服物務(wù)，多肽合成服務(wù)，蛋白表達和純化服務(wù)，抗體服務(wù)和細胞系建立^[11]等服務(wù)，而每個環(huán)節(jié)都有不同的反映機理?；蚬卜?wù)的流程是這樣的：

2.2.1載體信息

2.2生產(chǎn)流程敘述及其工藝分析

對于基因成品分裝。在分裝時一定不能出錯，每個質(zhì)粒對應(yīng)的質(zhì)粒的管子一定要一一對應(yīng)，要是在這個不發(fā)出錯的，后面的一系列的就會全錯，所有在基因成品分裝時一定要細心不能出錯。

對于QC酶切驗證規(guī)范，在酶切驗證的時候也是重要的一個步驟，如若加錯了酶會影響后面一個步驟-點樣。每個酶對應(yīng)的位點都是不一樣的，所以在驗證時一定要在酶切時注意加的酶的量和是否加錯酶。

在普通的小基因的訂單結(jié)束時候，同時需要準備ORF的訂單。簡單解釋一下ORF克隆服務(wù)傳統(tǒng)就是開放閱讀框（ORF）克隆需要從RNA的提取，cDNA反轉(zhuǎn)錄和PCR克隆開始。這些步驟不僅花費您一定的科研經(jīng)費，更花費您大量的寶貴時間。

ORF克隆能夠在短期內(nèi)合成您所需要的任何基因的ORF部分，從而從繁瑣的實驗步驟中節(jié)省出更多時間進行實驗設(shè)計和分析。Gene-on-Demand?平臺技術(shù)可以提供世界上最大的商用GenPool? ORF克隆數(shù)據(jù)庫，其中包括186種不同生物的2，428，863個ORF克隆，且這個數(shù)字還在不斷增加。

在ORF主要服務(wù)特色是可提供最大的商用ORF克隆數(shù)據(jù)庫;Gene-on-Demand?基因合成技術(shù)平臺;快速的ORF克隆服務(wù);最具競爭力的價格;從ORF克隆到蛋白表達分析的一站式服務(wù);可克隆至任意載體。

3 小結(jié)

（1）綜述以上所有，基因工程技術(shù)使藥品開發(fā)發(fā)生了根本性的轉(zhuǎn)變。傳統(tǒng)的藥品開發(fā)方式是在大量的化學(xué)合成物質(zhì)和微生物代謝產(chǎn)物中進行隨機篩選，得到其中的有效成分作為新的藥物。

（2）基因公共服務(wù)生產(chǎn)包括基因成品分裝和QC酶切驗證，這兩個是相互影響的關(guān)系，在做這兩個的同時一定要細心，仔細不能出錯，否則會影響后面一系列的;

（3）在QC酶切驗證的時候一定要等到一定的時間，才能拿產(chǎn)物，不然在點樣時，會有酶切不完全，而且在酶切的整個過程中加酶的量一定要足，酶的加入量是0.8微升，不能加少了這樣也會影響結(jié)果的;

（4）總的來說我們可以提出盡量加快分裝的速度和酶切的速度，來讓結(jié)果更早的出來，更早的可以基因成品分裝給訂單用戶，但是在保證速度快的情況下，也更要保證你所做的事是對的，要做到“保質(zhì)又保量”。

參考文獻

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