羧甲基石墨烯-精胺用于抗卵巢癌的研究

朝呼和，徐長(zhǎng)遠(yuǎn)，張西鋒*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100026；2.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430023)

卵巢癌已經(jīng)成為威脅人類(lèi)健康的主要疾病之一，其治療難度大，致死率高，給人類(lèi)生活帶來(lái)嚴(yán)重的負(fù)面影響。隨著納米藥物的出現(xiàn)以及高速發(fā)展，納米藥物也逐漸被人們熟知。納米材料是指在三維空間中的材料其至少有一維是納米級(jí)別，尺寸在0.1～100 nm之間[1-2]。石墨烯(Graphene)是一種由碳原子以sp2雜化軌道組成六角型呈蜂巢晶格的二維碳納米材料，具有優(yōu)異的光學(xué)、電學(xué)、力學(xué)特性，在材料學(xué)、微納加工、能源等方面具有重要的應(yīng)用前景，被認(rèn)為是一種未來(lái)革命性的材料[3-4]。此外，在生物學(xué)領(lǐng)域也開(kāi)始研究石墨烯的應(yīng)用，除了已經(jīng)提到的物理和化學(xué)性質(zhì)之外，納米材料具有優(yōu)良的生物學(xué)特性，如可用于抗菌、生物傳感技術(shù)、細(xì)胞成像和藥物傳遞，以及抗癌活性。氧化石墨烯是石墨烯的氧化物，氧化石墨烯羧甲基化后即得到羧甲基石墨烯，在此基礎(chǔ)上我們合成了羧甲基石墨烯-精胺(CGS)。CGS具有可調(diào)控的微納結(jié)構(gòu)和宏觀形態(tài)；CGS可抑制Skov3細(xì)胞的增殖，引起細(xì)胞內(nèi)活化氧(ROS)的表達(dá)量的增加，并誘導(dǎo)細(xì)胞的線粒體膜電位降低。此為CGS用于生殖系統(tǒng)疾病的治療奠定了良好的基礎(chǔ)。本研究利用卵巢癌細(xì)胞模型，借助傅里葉變換紅外光譜、掃描電子顯微鏡X射線衍射和原子力顯微鏡等檢測(cè)手段，研究CGS的抗腫瘤活性。

材料與方法

一、材料和設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)所用羧甲基石墨烯-精胺(CGS)為本實(shí)驗(yàn)合成。S-3000N掃描電子顯微鏡(SEM)購(gòu)自日本日立公司，X射線粉末衍射儀(XRD)購(gòu)自美國(guó)布魯克公司，傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)購(gòu)自美國(guó)PE公司，原子力顯微鏡(AFM)購(gòu)自美國(guó)Asylum Research公司。噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京博潤(rùn)萊特科技；ROS測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京邁博生物科技；線粒體膜電位檢測(cè)(JC-1)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技；卵巢癌細(xì)胞(Skov3)購(gòu)自上海富衡生物科技有限公司。

二、方法

1.CGS樣品的FTIR、SEM、XRD和AFM檢測(cè)：CGS樣品的FTIR、SEM、XRD和AFM表征分析檢測(cè)方法按照各操作規(guī)程要求進(jìn)行。

2.細(xì)胞的培養(yǎng)、MTT檢測(cè)、JC-1和ROS分析：卵巢癌細(xì)胞(Skov3)培養(yǎng)于含10%胎牛血清(Gibco，上海江林生物科技)和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，上海江林生物科技)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。MTT檢測(cè)、ROS檢測(cè)和JC-1檢測(cè)等參照試劑盒說(shuō)明書(shū)的檢測(cè)方法，并參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-7]。

3.CGS液的配制：稱(chēng)取0.01 g的CGS粉末，溶解于100 ml細(xì)胞培養(yǎng)基(10%胎牛血清+1%雙抗的DMEM/F12)中并超聲處理5 min，即配置成濃度為100 μg/ml的CGS液，然后再用細(xì)胞培養(yǎng)基(10%胎牛血清+1%雙抗的DMEM/F12)分別稀釋為20、40、60和80 μg/ml各濃度的CGS液。對(duì)照組為CGS濃度為0 μg/ml。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0中文版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本研究中所得到的數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次，并采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)，行t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、CGS的FTIR光譜分析

FTIR檢測(cè)結(jié)果顯示，在3 415.42 cm-1、1 629.37 cm-1、1 402.08 cm-1、1 058.39 cm-1位置有CGS吸收峰，在3 415.42 cm-1吸收峰是由于N-H的伸縮振動(dòng)，在1 629.37 cm-1吸收峰處為-COOH的伸縮振動(dòng)吸收峰。這表明羧甲基已成功引入到石墨烯上，1 402.08 cm-1吸收峰為C-H的彎曲振動(dòng)，1 058.39 cm-1為C-O-C鍵的不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收峰(圖1)。

圖1 CGS的FTIR光譜分析結(jié)果

二、CGS的XRD光譜分析

圖2是CGS的XRD表征圖譜，圖中CGS在10.6°時(shí)有且只有一個(gè)峰，表明CGS復(fù)合納米材料中沒(méi)有其他雜質(zhì)。

圖2 CGS的XRD圖譜

三、CGS的SEM成像分析

從圖3可以看到，CGS隨機(jī)的分散沉積在石墨烯上，并且石墨烯層與層之間分布著CGS，整體呈波浪形。

圖3 CGS的SEM結(jié)果

四、CGS的AFM成像分析

圖4是典型的使用水分散后均勻涂在玻璃表面得到的CGS圖片，由此圖可以測(cè)量CGS的AFM的平均寬度，得到的結(jié)果是A-B為87.61 nm。

五、MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

以卵巢癌細(xì)胞Skov3為細(xì)胞模型來(lái)評(píng)估CGS的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的升高，Skov3細(xì)胞活性隨之下降。CGS的處理濃度為20、40、60、80、100 μg/ml處理24 h后，Skov3細(xì)胞的活性相比于對(duì)照組分別下降到81%、82%、77%、75%和66%，100 μg/ml時(shí)最為顯著(P<0.05)。但100 μg/ml濃度處理48 h與24 h相比較，細(xì)胞活性變化不顯著(P>0.05)(圖5)。CGS處理組對(duì)Skov3細(xì)胞活力有抑制作用，并有著濃度依賴(lài)性。

六、ROS檢測(cè)

結(jié)果顯示，Skov3細(xì)胞經(jīng)過(guò)CGS處理24 h后，DCF的熒光強(qiáng)度隨給藥濃度升高而增強(qiáng)，提示ROS隨給藥濃度升高而提高(圖6)。在80和100 μg/ml處理組，ROS的水平分別是0 μg/m處理組的100倍和252倍(P<0.01)。CGS會(huì)造成ROS水平的升高，提示CGS具有一定的細(xì)胞毒性。

圖4 CGS的AFM圖及統(tǒng)計(jì)結(jié)果

與濃度0 μg/ml組相比較，**P<0.01

七、JC-1檢測(cè)膜電位變化

Skov3細(xì)胞經(jīng)過(guò)CGS(80 μg/ml)處理24 h后，加入JC-1來(lái)測(cè)定線粒體膜電位(MMP)。圖7中可以看到與對(duì)照組相比，CGS組的紅色熒光顯著減弱，綠色熒光顯著增強(qiáng)，可知JC-1單體逐漸增加而JC-1聚集體逐漸減弱，說(shuō)明處理組細(xì)胞MMP去極化嚴(yán)重。

A：ROS檢測(cè)細(xì)胞圖片(×200)，0、20、40、60、80和100為CGS的濃度(μg/ml)；B：熒光強(qiáng)度分析；與濃度0 μg/ml組相比較，**P<0.01

圖7 JC-1的檢測(cè)結(jié)果

討論

卵巢癌是一種女性生殖道惡性腫瘤中發(fā)病率和致死率最高的腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。目前，常用的療法主要包括手術(shù)、激素治療、化療、放療、免疫療法和靶向治療。納米級(jí)藥物及其載藥系統(tǒng)在腫瘤治療中的應(yīng)用逐漸引起關(guān)注。石墨烯及其復(fù)合物以其獨(dú)有的特性，已廣泛用于癌癥的診斷和治療。利用石墨烯將光轉(zhuǎn)化為電能的特性，用于刺激活細(xì)胞，從而在不傷害健康細(xì)胞的情況下，達(dá)到殺死癌細(xì)胞的目的[8]。癌細(xì)胞與正常人體細(xì)胞活躍程度不同，利用石墨烯與之接觸會(huì)發(fā)生不同程度的變化，可用于早期癌癥的無(wú)創(chuàng)診斷[9]。利用石墨烯制備的納米傳感器，同樣可以用于肺癌早期診斷[10]。經(jīng)聚乙烯亞胺修飾的石墨烯具有穩(wěn)定的熒光成像，并增強(qiáng)了對(duì)癌細(xì)胞的光熱和細(xì)胞毒性活性[11]。氧化石墨烯與納米銀形成的納米復(fù)合物(rGO-Ag)可以抑制卵巢癌細(xì)胞Skov3的增殖，引起胞內(nèi)ROS的增高和核內(nèi)DNA修復(fù)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。

本研究通過(guò)FTIR檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)CGS吸收峰在3 415.42 cm-1、1 629.37 cm-1、1 402.08 cm-1、1 058.39 cm-1有4處吸收峰。XRD圖譜表明，CGS在10.6°時(shí)有且只有一個(gè)峰，表明CGS復(fù)合納米材料中沒(méi)有其它雜質(zhì)。SEM表明相鄰的石墨烯層被隔開(kāi)，有很好的分散性。AFM展示了良好分散的CGS形態(tài)學(xué)特征，進(jìn)一步證實(shí)了這些顆粒的粒徑大約分布在87 nm左右。由此表明CGS具有良好的特性。CGS通過(guò)影響卵巢癌Skov3細(xì)胞的細(xì)胞活力，抑制卵巢癌Skov3細(xì)胞的增殖，且CGS的抑制能力有一定的濃度依賴(lài)性。線粒體是細(xì)胞中參與能量轉(zhuǎn)換的重要細(xì)胞器，線粒體功能是否正常直接影響到細(xì)胞的活性，線粒體膜電位的變化可以反映線粒體的功能[13-14]。CGS處理組細(xì)胞去極化嚴(yán)重，ROS普遍存在于細(xì)胞中。正常細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生和代謝處于一個(gè)平衡狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞中ROS的水平上升，會(huì)激活相應(yīng)的信號(hào)通路，產(chǎn)生細(xì)胞損傷、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15-17]。本研究中，CGS引起ROS水平升高，提示CGS對(duì)癌細(xì)胞具有較好的細(xì)胞毒性作用，CGS具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的活性。因此，CGS具有可調(diào)控的微納結(jié)構(gòu)和宏觀形態(tài)；CGS可抑制Skov3細(xì)胞的增殖，引起細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)量的增加，并誘導(dǎo)細(xì)胞的線粒體膜電位降低。此為CGS用于生殖系統(tǒng)疾病的治療奠定了良好的基礎(chǔ)。