樟樹(shù)葉精油抗PM2.5致肺上皮細(xì)胞損傷的研究

熊國(guó)紅 - 林 海 何建國(guó) - 李應(yīng)洪 - 付湘晉 -

(1. 益陽(yáng)市產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 益陽(yáng) 413000；2. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

懸浮于空氣中的固態(tài)和/或液態(tài)微粒中空氣動(dòng)力學(xué)當(dāng)量直徑≤2.5 μm的顆粒物被稱為PM2.5。肺上皮細(xì)胞是最直接接觸PM2.5的細(xì)胞之一，已有大量研究PM2.5對(duì)肺上皮細(xì)胞的損傷及機(jī)制的報(bào)道[1]。PM2.5通過(guò)：① 引起細(xì)胞內(nèi)大量生成ROS 等自由基；② 激活NF-κB等炎性信號(hào)通路引起炎癥因子大量生成，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或者壞死[2-3]。據(jù)翟文慧等[1]報(bào)道，隨著PM2.5濃度升高、染毒時(shí)間延長(zhǎng)，肺上皮細(xì)胞(A549細(xì)胞)中炎性因子IL-6、TNF-α表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；劉濤等[4]報(bào)道，PM2.5能夠造成肺上皮細(xì)胞A549的氧化損傷、炎性損傷和DNA鏈斷裂。在環(huán)境污染近期很難徹底治理好的現(xiàn)實(shí)情況下，如何避免、預(yù)防PM2.5損傷人體，已經(jīng)引起人們的普遍關(guān)注[5]。

目前有大量從抗氧化、抗炎癥角度篩選PM2.5拮抗劑的研究[6]。如大鼠口服維生素E后肺泡灌洗液中的氧化性指標(biāo)LDH、MDA、ACP和AKP水平有所下降，可在一定程度上拮抗由PM2.5引起的大鼠肺組織細(xì)胞的氧化損傷[7]。王鶴潼等[8]發(fā)現(xiàn)復(fù)方精油可能通過(guò)抑制TLR4/MyD88通路及NLRP3炎癥小體活化減少IL-1β表達(dá)并抑制Th免疫反應(yīng)從而減輕PM2.5所致的急性肺炎。N-乙酰半胱氨酸(NAC)可抑制由PM2.5激活的NF-κB信號(hào)通路，降低血清和肺組織中炎性因子的表達(dá)，提高大鼠的抗氧化能力，減輕PM2.5所致肺損傷[9]。也有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)一些天然產(chǎn)物可顯著拮抗PM2.5誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，如綠原酸、阿魏酸和葒草素[4]、竹葉提取物、紅豆越橘提取物[10]。

樟樹(shù)葉精油有一定的抗氧化活性和很好的抗炎活性[11]，對(duì)肺部疾病有明顯的治療作用[12]。所以，樟樹(shù)葉精油也可能對(duì)PM2.5致細(xì)胞損傷有拮抗作用，但目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。而且，精油可做成氣體劑型，比上述研究所用到的口服劑型可能更易直接作用于肺部。由于肺Ⅱ型上皮細(xì)胞在體外不能傳代，人肺癌(A549)細(xì)胞具有肺Ⅱ型上皮細(xì)胞特性[13]，所以，試驗(yàn)擬采用A549細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)研究，以探究樟樹(shù)葉精油對(duì)PM2.5所致A549細(xì)胞損傷的拮抗作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樟樹(shù)葉精油：以采于廈門(mén)牡丹香化有限公司基地的樟樹(shù)葉為原料，利用亞臨界萃取法萃取的精油；以正丁烷為萃取溶劑，萃取壓力8 MPa，萃取溫度50 ℃、萃取解析溫度70 ℃，萃取時(shí)間50 min；試驗(yàn)所用的是桉油素型，主要成分包括β-月桂烯(0.86%)、石竹烯(4.75%)、α-石竹烯(2.62%)、桉葉油醇(24.74%)、α-萜品醇(1.07%)、芳樟醇(5.82%)、棕櫚酸(8.55%)、亞油酸(4.30%)、9,12-十八碳二烯酸(6.83%)等；

A549細(xì)胞株：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心；

胎牛血清：天津市財(cái)慧生化制品廠；

PMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基：美國(guó)Gibco公司；

CCK-8試劑盒：日本同仁化學(xué)研究所；

細(xì)胞裂解液、蛋白濃度測(cè)試盒：碧云天生物技術(shù)研究所；

胰蛋白酶：酶活2 500 U/mg，美國(guó)Sigma公司；

IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒：美國(guó)R&D公司；

MDA、SOD、CAT、T-AOC測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)儀器

大流量采樣器：G1200型，美國(guó)Andersen公司；

真空冷凍干燥機(jī)：LGJ-10型，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；

冷凍離心機(jī)：TGL-16GR型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

酶標(biāo)儀：550型，美國(guó)伯樂(lè)(Bio-Rad)公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 顆粒物樣品的采集、處理 采樣時(shí)間為2016年1月，采樣地點(diǎn)位于長(zhǎng)沙某城區(qū)，采樣位置離地面高度約10 m，使用G1200型大流量PM2.5采樣器(采樣流量1 m3/min)連續(xù)24 h收集大氣顆粒物，使用QM-A型石英纖維濾膜吸附顆粒物，采樣后的濾膜用鋁箔紙包好。

將吸附有PM2.5的濾膜浸泡入去離子水中，超聲處理20 min洗脫出顆粒物，將顆粒物樣品真空冷凍干燥24 h，稱重，加入PBS配制成不同濃度的PM2.5懸液，高壓滅菌，2～8 ℃冰箱保存，臨用前超聲15 min充分混勻。

1.3.2 PM2.5染毒劑量的確定 將生長(zhǎng)狀況良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化，配成2×105mL-1的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，用37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，加入50，150，200，250，300 μg/mL的PM2.5懸液并繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入按1∶9稀釋的CCK-8溶液100 μL，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率，以存活率50%左右的PM2.5懸液濃度為后續(xù)試驗(yàn)染毒劑量。

1.3.3 精油對(duì)A549細(xì)胞的保護(hù)作用 試驗(yàn)分為空白對(duì)照組、PM2.5損傷組和精油保護(hù)組。用0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，用濃度10%胎牛血清的PMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度2×105mL-1，1 mL/孔，接種到24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h。試驗(yàn)組加入0.05，0.10，0.50，1.00，5.00，10.00 mg/mL的精油預(yù)保護(hù)6 h，棄上清液，加入200 μg/mL PM2.5 繼續(xù)作用20 h，PM2.5損傷組只加入200 μg/mL PM2.5，空白組只加入等量的PBS；然后吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入按1∶9稀釋的CCK-8溶液100 μL，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.4 細(xì)胞存活率計(jì)算

(1)

1.3.5 細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD、CAT、T-AOC水平測(cè)定 用直徑10 cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞，精油處理后收集細(xì)胞，用4 ℃ 的PBS洗滌2遍，用細(xì)胞裂解液裂解，冷凍離心(4 ℃，1 600×g)10 min，取上清液；根據(jù)試劑盒方法測(cè)定MDA含量、SOD活性、CAT活性、T-AOC，同時(shí)測(cè)定蛋白濃度，校正細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD、CAT、T-AOC 水平。

1.3.6 炎性因子水平測(cè)定 吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清液按照試劑盒方法說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞炎性因子水平測(cè)定，同時(shí)測(cè)定蛋白含量，校正細(xì)胞炎性因子水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)數(shù)資料組間比較采用X2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，采用方差分析比較，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞的毒性

從表1可以看出，PM2.5對(duì)細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著濃度的增加，A549存活率逐漸降低。半致死劑量約在200 μg/mL，所以，后續(xù)染毒試驗(yàn)均采用200 μg/mL。

表1 PM2.5劑量對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響?

? 同列字母不同代表有顯著差異(P<0.05)。

由表1可知PM2.5濃度為0.20 mg/mL時(shí)，A549細(xì)胞存活率為(52.8±2.8)%，與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致。

2.2 樟樹(shù)葉精油對(duì)A549細(xì)胞增殖及存活率的影響

從表2可以看出，樟樹(shù)葉精油安全性非常高，1.0 mg/mL以內(nèi)對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響，低濃度有一定促進(jìn)作用；但當(dāng)濃度>5 mg/mL時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞有抑制作用。祖桂芳等[10]報(bào)道，竹葉提取物對(duì)細(xì)胞增殖的影響表現(xiàn)為低濃度(0.05，0.10 mg/mL)有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，而高濃度(0.20 mg/mL以上)有一定程度的抑制作用；紅豆越橘提取物對(duì)細(xì)胞增殖的影響表現(xiàn)為濃度在0.05～0.40 mg/mL時(shí)可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，細(xì)胞存活率最高達(dá)255%，而當(dāng)濃度達(dá)到0.80～3.20 mg/mL時(shí)才顯示出抑制細(xì)胞增殖的作用。所以，樟樹(shù)葉精油對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響與竹葉提取物、紅豆越橘提取物類似。

從表2可以看出，0.05～1.00 mg/mL樟樹(shù)葉精油對(duì)PM2.5所致的細(xì)胞毒性作用有顯著的拮抗作用(P<0.05)；但添加量達(dá)到5.0 mg/mL時(shí)，保護(hù)作用消失。樟樹(shù)葉精油在高濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制作用可能與其主要成分桉葉油醇的細(xì)胞毒性有關(guān)。

表2 樟樹(shù)葉精油濃度對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響

? 同列字母不同代表有顯著差異(P<0.05)。

2.3 樟樹(shù)葉精油對(duì)A549細(xì)胞胞內(nèi)氧化應(yīng)激的影響

氧化損傷是PM2.5細(xì)胞毒性的主要機(jī)制之一。丙二醛(MDA)含量、SOD、CAT、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、總抗氧化能力(T-AOC)等是表征細(xì)胞氧化還原狀態(tài)最常用的指標(biāo)。MDA是最常見(jiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，其含量廣泛用于反映細(xì)胞脂質(zhì)氧化程度。SOD、CAT、GSH-Px是細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)重要組成部分，可阻止活性氧的產(chǎn)生或者清除活性氧[14]。從表3 可以看出，PM2.5損傷細(xì)胞后MDA 含量顯著增高(P<0.05)。劉婷等[15]發(fā)現(xiàn)，PM2.5損傷肺巨噬細(xì)胞24 h，細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT活性和T-AOC均明顯降低，大于33 μg/mL的PM2.5可使MDA顯著升高(P<0.05)。表3還表明，樟樹(shù)葉精油可顯著降低染毒細(xì)胞中MDA含量，增加SOD、CAT活性和T-AOC含量(P<0.05)，表明樟樹(shù)葉精油可通過(guò)抗氧化應(yīng)激拮抗PM2.5致細(xì)胞毒性。

2.4 樟樹(shù)葉精油對(duì)A549細(xì)胞炎性因子的影響

PM2.5濃度升高及暴露時(shí)間延長(zhǎng)可能導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，從而造成機(jī)體損害[16]。TNF-α、IL-6均為介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，由單核巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等分泌。TNF-α是機(jī)體炎癥介質(zhì)連鎖反應(yīng)中的啟動(dòng)因子、中心介質(zhì)[17]。TNF-α能調(diào)節(jié)IL-1、IL-6等其他細(xì)胞炎癥因子的釋放。IL-6是急性炎癥反應(yīng)的主要標(biāo)志物之一，來(lái)源于多種細(xì)胞[18-19]。因此，檢測(cè)肺上皮細(xì)胞A549的IL-6、TNF-α含量，可以推斷樟樹(shù)葉精油拮抗PM2.5致肺上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)的機(jī)制。

表3 樟樹(shù)葉精油對(duì)A549細(xì)胞中MDA、SOD、CAT和T-AOC的影響?

? 同列字母不同代表有顯著差異(P<0.05)。

由表4可以發(fā)現(xiàn)：樟樹(shù)葉精油可顯著降低染毒細(xì)胞中炎性因子TNF-α、IL-6的含量(P<0.05)；表明樟樹(shù)葉精油可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)拮抗PM2.5致細(xì)胞毒性。此前，焦周光等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在染毒濃度為100 μg/mL及以上時(shí)，PM2.5可使細(xì)胞IL-6分泌量顯著增加。試驗(yàn)獲得類似結(jié)果。

表4樟樹(shù)葉精油對(duì)炎性因子TNF-α、IL-6含量的影響?

Table 4 Effects of camphor leaves’essential oil on PM2.5(0.2 mg/mL)induced TNF-αand IL-6(n=3)

組別TNF-α/(pg·mL-1)IL-6/(pg·mL-1)空白140±10e70±10dPM2.5600±30a230±20a精油0.05 mg/mL310±10b140±20b精油0.10 mg/mL200±10d70±10d精油0.50 mg/mL220±20cd80±10cd精油1.00 mg/mL250±10c90±10c

? 同列字母不同代表有顯著差異(P<0.05)。

3 結(jié)論

樟樹(shù)葉精油安全性較高，1.0 mg/mL以內(nèi)對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響；0.05～1.00 mg/mL樟樹(shù)葉精油對(duì)PM2.5所致的細(xì)胞毒性作用有顯著的拮抗作用(P<0.05)。通過(guò)抗氧化應(yīng)激及抑制炎癥反應(yīng)可能是樟樹(shù)葉精油拮抗PM2.5致細(xì)胞毒性的機(jī)制。但由于樟樹(shù)葉精油成分復(fù)雜，其準(zhǔn)確的活性成分還需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。