HPLC測(cè)定羅布麻茶黃酮主要組成成分及其體外抗氧化特性研究

張 靜 任小利 - 李希希 - 易 沙 李 沖 趙 欣 n

(1. 重慶化工職業(yè)學(xué)院環(huán)境與質(zhì)量檢測(cè)學(xué)院，重慶 401228；2. 重慶第二師范學(xué)院重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400067)

羅布麻屬野生草本多年半灌木，多分布于中國(guó)西北地區(qū)[1]。羅布麻葉除被作為中藥使用外，也被加工成茶類飲品使用。羅布麻葉含有黃酮類、有機(jī)酸類、苯丙素類及多種氨基酸和礦物質(zhì)，能起到降血壓、降膽固醇、抗衰老、提高免疫力[2-5]及抗抑郁[6-7]等功效。植物黃酮是一類具有較強(qiáng)抗氧化能力的物質(zhì)，能有效清除自由基[4-5]。黃酮類為羅布麻葉中最主要的功效成分[8]，羅布麻葉所含黃酮類成分主要有蘆丁、槲皮素、異槲皮苷、金絲桃苷、木樨草素等[8-10]。羅布麻部分生理活性作用已得到初步驗(yàn)證，主要是基于羅布麻的粗提物，而羅布麻活性成分與其作用間的關(guān)系尚未清楚，尤其是對(duì)羅布麻黃酮成分的分析及產(chǎn)生抗氧化活性作用的機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。

羅布麻茶黃酮成分的提取方法主要有超聲提取法[11]、加熱回流法[12]、聚酰胺層析法[13]、大孔樹(shù)脂法[14]。蘆丁和異槲皮苷均為多羥基黃酮類化合物，結(jié)構(gòu)中存在大量的羥基，極性強(qiáng)，易溶于極性溶劑。試驗(yàn)擬采用減壓加熱回流結(jié)合大孔吸附法提取新疆羅布麻茶中的黃酮類物質(zhì)，通過(guò)高效液相色譜分析法測(cè)定羅布麻茶黃酮中蘆丁和異槲皮苷含量，對(duì)羅布麻茶黃酮的體外抗氧化效果進(jìn)行檢測(cè)，并結(jié)合黃酮成分的分析結(jié)果對(duì)羅布麻茶黃酮的作用機(jī)制進(jìn)行闡述，為羅布麻茶進(jìn)一步功能性開(kāi)發(fā)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅布麻茶：野生羅布麻茶，新疆沙雅縣；

蘆丁、異槲皮苷對(duì)照品：分析純，北京索萊寶科技有限公司；

1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)：分析純，梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；

2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)：分析純，南京都萊生物技術(shù)有限公司；

VC(抗壞血酸)：分析純，北京索萊寶科技有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純，重慶川東化工有限公司；

乙酸、硫酸亞鐵、過(guò)硫酸鉀、30%過(guò)氧化氫、水楊酸、無(wú)水乙醇：分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜系統(tǒng)：Ultimate 3000型，美國(guó)Thermo Scientific公司；

多功能酶標(biāo)儀：Varioskan LUX型，美國(guó)Thermo Scientific公司；

超聲波清洗器：KQ-250ES型，昆山市超聲儀器有限公司；

電子分析天平：XB4200C型，瑞士Precisa公司；

超純水制造系統(tǒng)：UPH-Ⅱ-20T型，四川優(yōu)普超純科技有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-2000B，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 羅布麻茶黃酮提取 FL-3大孔樹(shù)脂先用無(wú)水乙醇浸泡24 h，再用3%鹽酸浸泡2 h后用蒸餾水沖洗至中性，用蒸餾水浸泡待用。將50 g干羅布麻茶粉碎過(guò)40目篩后在茶粉中加入70%乙醇(料液質(zhì)量比20∶1)，然后于60 ℃水浴中浸提3 h。提取液通過(guò)大孔樹(shù)脂后黃酮物質(zhì)被吸附，再用乙醇(50%，60%，70%，80%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))洗脫樹(shù)脂上的黃酮物質(zhì)，洗脫至樹(shù)脂無(wú)色即黃酮物質(zhì)完全被洗出，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸黃酮洗出液，最后得到蒸干的黃酮提取物。

1.3.2 標(biāo)品溶液配制 精密稱取適量蘆丁、異槲皮苷標(biāo)品，加入甲醇溶解，分別配制成濃度為1.812 5，1.033 3 mg/mL 的蘆丁、異槲皮苷標(biāo)品溶液。分別精密吸取0.2 mL蘆丁、異槲皮苷標(biāo)品液，再用甲醇配制成濃度分別為0.181 25，0.103 33 mg/mL 的混標(biāo)溶液。

1.3.3 樣品溶液 精密稱取0.5 g羅布麻多酚提取物粉末于10 mL容量瓶中，用甲醇進(jìn)行定容，超聲處理后用0.45 μm 濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.3.4 色譜條件 色譜柱AgilentzorbaxSB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，按表1進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.5%乙酸溶液，流速0.6 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)359 nm，進(jìn)樣量10 μL[15]。

表1 HPLC流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.3.5 線性關(guān)系 將蘆丁、異槲皮苷標(biāo)品溶液稀釋后分別進(jìn)樣1，2，4，8，12，16，20 μL，按1.3.4色譜條件進(jìn)行分析。以標(biāo)品進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)X，以相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)Y，得兩種標(biāo)品的線性方程。

1.3.6 精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

(1) 精密度試驗(yàn)：取上述混標(biāo)溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，按上述1.3.4色譜條件對(duì)峰面積進(jìn)行測(cè)定。

(2) 重現(xiàn)性試驗(yàn)：精密稱取1.3.1方法制備好的樣品5份，按1.3.3方法制備待測(cè)樣品溶液，在1.3.4色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。

(3) 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一樣品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12，24 h按1.3.4色譜條件對(duì)蘆丁、異槲皮苷的峰面積進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品3份，按1.3.3方法制備樣品溶液，分別配制成1.3.2中蘆丁、異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度的80%，100%，120%，在已知的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，每份樣品測(cè)定3次，計(jì)算回收率、平均回收率及RSD值。

1.3.8 樣品含量測(cè)定 稱取同一樣品粉末3份(每份接近0.1 g，平均0.097 3 g)，按1.3.3方法制備3份樣品溶液，用1.3.4色譜條件對(duì)樣品中蘆丁、異槲皮苷的峰面積進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算樣品中二者的含量及平均含量。

1.3.9 抗氧化能力測(cè)定 準(zhǔn)確稱取1.3.1得到的樣品粉末和VC，配置成1.0 mg/mL的樣品和VC溶液，依次加水稀釋成不同濃度的樣品和VC(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.8 mg/mL)溶液，備用。

(1) DPPH自由基清除試驗(yàn)：參照Aneta等[16-17]的方法，略有改進(jìn)。取3個(gè)離心管(標(biāo)記為A1，A2，A3)分別加入不同濃度的樣品和試劑。其中A1離心管中加入DPPH溶液2.9 mL、樣液100 μL；A2離心管中加入無(wú)水乙醇2.9 mL、樣液100 μL；A3離心管中加入DPPH溶液2.9 mL、80%甲醇溶液100 μL。均勻混合后，于暗處反應(yīng)30 min，517 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算DPPH清除率。以VC為陽(yáng)性對(duì)照。

(2) ABTS自由基清除試驗(yàn)：參照Ye等[18-19]的方法，略有改進(jìn)。取3個(gè)離心管(標(biāo)記為A1，A0，A空)分別加入不同濃度的樣品和試劑。其中A1離心管加入ABTS溶液2.0 mL、樣液80 μL；A0離心管加入超純水2.0 mL、樣液80 μL；A空離心管加入ABTS溶液2.0 mL、無(wú)水乙醇80 μL。均勻混合后，于暗處反應(yīng)6 min，734 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算ABTS自由基清除率。以VC為陽(yáng)性對(duì)照。

(3) 羥基自由基清除試驗(yàn)：參照賈榮等[20]方法，略有改進(jìn)。取3個(gè)離心管(標(biāo)記為A0，Ai，Aj)分別加入不同濃度的樣品和試劑。其中A0離心管加入80%甲醇300 μL、FeSO4溶液1.0 mL、水楊酸乙醇溶液1.0 mL 和H2O21.0 mL；Ai離心管加入樣液300 μL、FeSO4溶液1.0 mL、水楊酸乙醇溶液1.0 mL 和H2O21.0 mL；Aj離心管加入樣液300 μL、FeSO4溶液1.0 mL、水楊酸乙醇溶液1.0 mL 和80%甲醇溶液1.0 mL 。均勻混合后，于37 ℃ 水浴鍋中反應(yīng)30 min，510 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算羥基自由基清除率。以VC為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行3次平行測(cè)定，計(jì)算觀察指標(biāo)的平均值。采用Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇 試驗(yàn)比較了甲醇—水、乙腈—水流動(dòng)相對(duì)出峰時(shí)間和分離效果等的影響。通過(guò)比較基線分離和峰形對(duì)稱的要求發(fā)現(xiàn)，選擇乙腈—水作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫效果最佳，且蘆丁、異槲皮苷分離效果較好。由于加入酸可減少拖峰現(xiàn)象[18]，因此在水相中加入了0.5%磷酸，最終確定的流動(dòng)相為乙腈—0.5%磷酸水溶液。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 在254，280，328，359 nm進(jìn)樣檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，蘆丁、異槲皮苷在359 nm時(shí)響應(yīng)最好，色譜峰面積較大且分離效果好。故選擇359 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，此波長(zhǎng)處蘆丁、異槲皮苷均有較強(qiáng)吸收峰(圖1)。

1. 蘆丁 2. 異槲皮苷

2.1.3 線性關(guān)系分析 進(jìn)一步的試驗(yàn)顯示蘆丁、異槲皮苷的線性方程分別為Y=26.026X+10.496(R2=0.999 55)，Y=45.57X+4.580 7(R2=0.999 65)，且分別在0.453 1～9.062 5，0.258 3 ～5.166 5 μg的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.4 精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性試驗(yàn) 在精密度驗(yàn)證中蘆丁和異槲皮苷的峰面積RSD值分別為0.11%和0.10%(n=5)，表明本方法的精密度良好。在重現(xiàn)性驗(yàn)證中蘆丁和異槲皮苷含量的RSD值分別為1.57%和1.09%(n=5)，表明本方法重現(xiàn)性良好。在穩(wěn)定性驗(yàn)證中蘆丁和異槲皮苷的RSD值分別為1.16%和0.42%，表明蘆丁和異槲皮苷在樣品溶液中至少24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.1.5 回收率 由表2可知，蘆丁、異槲皮苷的平均回收率分別為99.91%，100.05%(n=9)，表明高效液相法用于羅布麻茶黃酮的質(zhì)量控制具有良好的準(zhǔn)確性。

2.1.6 樣品含量測(cè)定 由表3可知，羅布麻茶黃酮中含有一定量的蘆丁和異槲皮苷，占黃酮總量的50%以上，且異槲皮苷含量高且穩(wěn)定，與文獻(xiàn)[15]報(bào)道結(jié)果基本一致。

2.2 樣品提取方法的優(yōu)化

由表4可知，當(dāng)乙醇濃度<70%時(shí)，隨著乙醇濃度的增加，蘆丁、異槲皮苷提取量均明顯增加；但當(dāng)乙醇濃度>70%時(shí)，蘆丁、異槲皮苷提取量均減小。故確定以70%乙醇為提取溶劑。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 羅布麻茶黃酮中蘆丁、異槲皮苷含量

表4乙醇濃度對(duì)羅布麻茶黃酮中蘆丁、異槲皮苷提取量的影響

Table 4 Effect of ethanol concentration on the extraction of rutin and isoquercetin inApocynumvenetumtea

乙醇濃度/%蘆丁含量/mg異槲皮苷含量/mg500.050 3±0.000 50.638 8±0.040 8600.054 9±0.000 50.658 1±0.041 2700.059 6±0.000 60.673 9±0.039 7800.056 8±0.000 40.663 7±0.039 1

2.3 羅布麻茶體外抗氧化評(píng)價(jià)

2.3.1 清除DPPH自由基的能力 由圖2可知，在一定濃度范圍內(nèi)羅布麻茶黃酮樣品和VC樣品對(duì)DPPH均有一定的清除作用。隨著羅布麻茶黃酮樣品濃度的增加，對(duì)DPPH自由基清除作用不斷增強(qiáng)，當(dāng)其濃度為0.3 mg/mL時(shí)清除能力最大，清除率達(dá)73.1%，此后隨著濃度增加清除率趨于平穩(wěn)。羅布麻茶黃酮清除能力明顯高于同濃度的VC對(duì)DPPH的清除能力，說(shuō)明羅布麻茶純化后的黃酮樣品有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力。

圖2 羅布麻茶黃酮的DPPH清除率

2.3.2 清除ABTS自由基的能力 由圖3可知，羅布麻茶黃酮對(duì)ABTS自由基有一定的清除能力，隨著樣品濃度的增加，清除能力逐漸增強(qiáng)。在樣品濃度為1 mg/mL時(shí)清除率高達(dá)60.2%，此時(shí)VC對(duì)ABTS的清除率僅為20.8%，故羅布麻茶清除ABTS自由基的能力較強(qiáng)。

圖3 羅布麻茶黃酮的ABTS清除率

2.3.3 清除羥基自由基的能力 由圖4可知，當(dāng)羅布麻茶黃酮樣品和VC濃度在0.2～0.4 mg/mL時(shí)，清除能力相當(dāng)，清除率在6%～10%；隨著樣品濃度的增加，羅布麻茶黃酮對(duì)羥基自由基清除率明顯增強(qiáng)，當(dāng)濃度為1.0 mg/mL 時(shí)，清除率達(dá)25.7%，清除能力遠(yuǎn)大于同濃度VC，可能與黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)中所含羥基數(shù)有關(guān)。

3 結(jié)論

試驗(yàn)利用高效液相色譜法測(cè)定了羅布麻茶黃酮中蘆丁、異槲皮苷含量，并通過(guò)體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)羅布麻茶黃酮對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基和羥基自由基均具有良好的清除作用。本研究中提取的羅布麻茶黃酮中蘆丁、異槲皮苷含量占黃酮總量的50%以上，通過(guò)包括蘆丁、異槲皮苷在內(nèi)的黃酮起到了較好的體外清除自由基能力。但本研究中只針對(duì)含量最高的蘆丁和異槲皮苷含量進(jìn)行了具體分析，研究[21-22]顯示，不同的羅布麻黃酮還含有金絲桃苷、槲皮苷、白麻苷、山萘酚-3-O-β-D-蕓香糖苷、扁蓄苷和乙?；鸾z桃苷等物質(zhì)，因此羅布麻茶黃酮成分分析及各物質(zhì)間的協(xié)同作用有待進(jìn)一步研究。

圖4 羅布麻茶黃酮的羥基自由基清除率