UPLC-MS/MS測定豬肝中五氯酚殘留量的不確定度評定

歐陽麗- 汪 輝 何 翊 陳婭婭CN - 胡婷舒 - 劉曼舒 -

(長沙市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 長沙 410016)

五氯酚(pentachlorophenol，PCP)及其鈉鹽具有殺蟲、防腐、除草等作用[1]，但具有明顯的生物毒性[2]，美國環(huán)境保護(hù)局已將其列為114種主要環(huán)境污染物之一[3-4]。中國農(nóng)業(yè)部公告第193號規(guī)定禁止五氯酚用于所有食用性動(dòng)物[5]。高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法因具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，已成為動(dòng)物源性食品中五氯酚殘留量檢測的國標(biāo)方法[6]。

作為衡量檢測結(jié)果可信度的重要指標(biāo)[7]，測量不確定度在評定試驗(yàn)結(jié)果的可信性、可比性、可接受性以及檢測過程中需注意的關(guān)鍵環(huán)節(jié)等方面都具有十分重要的意義[8]。中國實(shí)驗(yàn)室國家認(rèn)可委員會(CNACL)對檢測實(shí)驗(yàn)室測量不確定度評定程序的制定與應(yīng)用提出了明確的要求[9]。目前尚未見對動(dòng)物源性食品中五氯酚殘留量的檢測結(jié)果進(jìn)行不確定度評定的報(bào)道。肝臟作為代謝器官，負(fù)責(zé)處理各種代謝廢物與毒素，是五氯酚殘留量相對較高的動(dòng)物源性食品，為衡量檢測結(jié)果的可信度，試驗(yàn)依據(jù)GB 23200.92—2016對豬肝樣品進(jìn)行檢測，并參照現(xiàn)行有效的化學(xué)分析中不確定度評定方法及指南[10-12]對豬肝中五氯酚殘留量的檢測結(jié)果進(jìn)行不確定度評定，以期提高五氯酚殘留量測量結(jié)果的科學(xué)性，為五氯酚殘留量的檢測提供切實(shí)可行的建議。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

五氯酚鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度86.0%，CAS號123333-54-0，德國Dr. Ehrenstorfer公司；

甲醇、乙腈：色譜純，德國MERCK公司；

豬肝：市場抽檢樣品；

實(shí)驗(yàn)室用水：Milli-Q超純水；

Oasis MAX固相萃取柱：60 mg，3 mL，美國Waters公司；

超高效液相色譜—四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：Acquity uplc?H-Class/Xevo?tq-s micro型，美國Waters公司；

快速混勻器：SK-1型，江蘇金壇醫(yī)療儀器廠；

高速離心機(jī)：CT14D型，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；

固相萃取真空裝置：Visiprep-DL 24型，美國Sigma-Aldrich公司；

超聲波清洗器：AS3120型，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；

全自動(dòng)高通量平行濃縮儀：MV5型，美國Labtech公司；

分析天平：XSE205型，德國Mettler-Toledo公司。

1.2 方法

1.2.1 五氯酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備 精確稱取五氯酚鈉12.59 mg至50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18 ℃以下避光保存；用1 mL單標(biāo)線吸量管移取1 mL五氯酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，配制成濃度為2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。用1 mL單標(biāo)線吸量管移取1 mL標(biāo)準(zhǔn)中間溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀釋并定容至刻度，稀釋成濃度為200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。用移液器分別移取適量標(biāo)準(zhǔn)使用液于5支2 mL容量瓶中，用空白樣品基質(zhì)溶液稀釋并定容至刻度，配制成五氯酚濃度為1，5，10，20，50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，供超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.2.2 堿性乙腈水溶液提取 稱取均質(zhì)試樣2 g于10 mL 具螺旋蓋聚丙烯離心管中，加入6 mL 5%三乙胺的乙腈—水溶液，渦旋1 min，超聲提取5 min。3 000 r/min離心5 min，收集上清液于一具刻度離心管中。離心后的殘?jiān)眉s6 mL 5%三乙胺的乙腈—水溶液重復(fù)上述提取步驟1次，合并上清液，混勻。

1.2.3 固相萃取凈化 將所得提取溶液轉(zhuǎn)入經(jīng)過預(yù)處理的MAX固相萃取柱中，以1滴/s流速使樣品溶液全部通過固相萃取柱，棄去流出液。依次用5 mL 5%氨水溶液、5 mL甲醇、5 mL 2%甲酸的甲醇—水溶液淋洗，棄去流出液，淋洗液全部流出后，固相萃取柱用真空泵抽干5 min。以4 mL 4%甲酸甲醇溶液洗脫，15 mL具刻度試管收集洗脫液，40 ℃水浴下吹氮濃縮至1 mL，用水定容至2 mL，混勻。溶液以0.22 μm有機(jī)膜過濾，供測定。

1.2.4 液相色譜條件 色譜柱：Acquity uplc BEH C18液相色譜柱(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)；流動(dòng)相流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相：A(5 mmol/L乙酸銨溶液)+B(甲醇)，梯度洗脫程序：0.00～1.00 min，40%～100% B；1.00～5.00 min，100% B；5.01～5.50 min，100% ～40% B；5.50～9.00 min，40% B；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.5 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源，負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：2.0 kV；錐孔電壓：20 V；離子源溫度：150 ℃；錐孔反吹氣流量：60 L/h；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流量：700 L/h；數(shù)據(jù)采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。儀器參數(shù)見表1。

表1 儀器參數(shù)?

? 保留時(shí)間4.12 min；a為定量離子。

1.2.6 不確定度數(shù)學(xué)模型的建立 測量不確定度數(shù)學(xué)模型：

(1)

式中：

X——樣品中五氯酚殘留量，μg/kg；

c——由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線獲得樣品進(jìn)樣液中五氯酚的濃度，ng/mL；

V——樣品最后定容體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g；

R——加標(biāo)回收率，%；

frep——樣品測量重復(fù)性；

fc標(biāo)——校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液影響因子。

2 不確定度評估

2.1 各分量不確定度來源

根據(jù)檢測過程與數(shù)學(xué)模型，標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與稀釋、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品稱量、樣品測量重復(fù)性、樣品最后定容、樣品加標(biāo)回收等環(huán)節(jié)引入的不確定度為五氯酚殘留量測定結(jié)果不確定度的主要來源。

2.2 不確定度分量的量化

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與稀釋引入的不確定度

(4) 標(biāo)準(zhǔn)中間溶液配制引入的不確定度：

(6) 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制引入的不確定度：

表2 移液器引入的不確定度

(6) 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和稀釋引入的合成不確定度為：

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度 取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液供超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，獲得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程為：A=5 355.3c+284.9(A為峰面積，c為濃度，ng/mL)，相關(guān)系數(shù)為0.999 7，測定結(jié)果見表3。

根據(jù)式(2)～(4)計(jì)算最小二乘法擬合曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度與相對不確定度。

表3 五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液測定結(jié)果

(2)

(3)

(4)

式中：

u(curve)——標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，ng/mL；

urel(curve)——標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對不確定度；

S(A)——?dú)埐畹臉?biāo)準(zhǔn)差；

P——測定樣品溶液的次數(shù)，日常檢測中每個(gè)樣品做2個(gè)平行即P=2；

N——獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定次數(shù)，N=5；

α——標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，α=5 355.3；

b——標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距，b=284.9；

c0——由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合得到的樣品溶液中五氯酚殘留量的濃度，c0=14.4 ng/mL；

ci——第i個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制濃度，ng/mL；

cj——第j個(gè)由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，ng/mL；

Aj——標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積。

將α，b，ci，Aj，N值代入式(3)，得S(A)=2 290.287 8；將S(A)代入式(2)，得u(curve)=0.359 1，則標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對不確定度μrel(curve)=0.024 94。

2.3 合成不確定度與擴(kuò)展不確定度

將各不確定度分量進(jìn)行合成得：

當(dāng)五氯酚含量為14 μg/kg時(shí)，合成不確定度為：u=urel×c=0.099 78×14=1.4 μg/kg，選擇95%置信概率，包含因子取k=2，則擴(kuò)展不確定度為：U(c樣)=u×k=3 μg/kg。豬肝中五氯酚殘留量的測量不確定度表示為：X=(14±3) μg/kg，k=2。

2.4 主要不確定度分量的相對貢獻(xiàn)

根據(jù)CNAS-GL006：2019規(guī)定的方法計(jì)算各不確定度分量的相對貢獻(xiàn)，結(jié)果如表4所示。從表4可知，樣品最后定容體積、樣品測量重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與稀釋引入的不確定度分量對合成不確定度的影響最大。

表4 各不確定度分量的相對貢獻(xiàn)

3 結(jié)論

研究對采用UPLC-MS/MS法測定豬肝中五氯酚殘留量的檢測結(jié)果進(jìn)行了不確定度評定。結(jié)果顯示，樣品最后定容體積、樣品重復(fù)性測量及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與稀釋等人員操作環(huán)節(jié)引入的不確定度最大，此部分不確定度的相對貢獻(xiàn)之和約為90%，為檢測結(jié)果不確定度的主要來源；標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合和樣品稱量等環(huán)節(jié)引入不確定度分量的相對貢獻(xiàn)約為10%；加標(biāo)回收引入的不確定度的相對貢獻(xiàn)最小，僅為0.27%。因此，在檢測過程中，樣品制備要均勻、建議選用純度更高的標(biāo)準(zhǔn)品、減少標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋步驟、定期校準(zhǔn)儀器，減少測定結(jié)果的不確定度，以提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。