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    土霉素完全抗原的制備及ELISA檢測方法的建立

    2019-10-15 08:23:04曹金博胡驍飛李燕虹曹夕丹邢云瑞孫亞寧鄧瑞廣張改平
    食品與機(jī)械 2019年9期
    關(guān)鍵詞:檢測方法

    曹金博 - 胡驍飛 - 王 耀 李燕虹 - 曹夕丹 -邢云瑞 - 孫亞寧 - 鄧瑞廣 - 張改平,3 -,3

    (1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450002;2. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院, 河南 洛陽 471003;3. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué),河南 鄭州 450000)

    土霉素(Oxytetracycline,OTC)屬于四環(huán)素類抗生素中的一種,其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示[1]。由于具有廣譜抗菌性,且價格低廉,因此被廣泛用于禽畜各種感染性疾病的治療,適量添加在動物飼料或飲水中還可有助于禽畜生長和疾病預(yù)防[2-3]。但由于禽畜養(yǎng)殖過程中長期、大量違規(guī)添加四環(huán)素類抗生素,導(dǎo)致其在動物源性食品以及環(huán)境中過量殘留,對人類健康造成極大威脅[4-5]。中國農(nóng)業(yè)部235號公告明確規(guī)定:牛奶和肌肉中四環(huán)素類抗生素最高殘留量不得超過100 μg/g,腎臟、肝臟、蛋中分別不得超過600,300,200 μg/g。

    圖1 OTC分子結(jié)構(gòu)式

    目前,高效液相色譜法、氣相色譜—質(zhì)譜法等檢測方法存在儀器昂貴、操作繁瑣、檢測不及時等局限,因而不適合樣品的現(xiàn)場篩查[6-8]。相比之下,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫層析試紙(Immunochromatographic assay,ICA)等免疫學(xué)快速檢測方法操作簡單、迅速,同樣具有良好的靈敏度和特異性,在大批量樣品現(xiàn)場篩查方面具有顯著優(yōu)勢[9-11]。該類方法依賴高效抗體對抗原進(jìn)行靈敏特異識別,但土霉素分子量小,無免疫原性,必需與載體蛋白偶聯(lián)制備完全抗原才能刺激機(jī)體免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體。目前,關(guān)于OTC完全抗原的制備雖有報道[12],但所獲得多抗血清的敏感性和特異性有待提高。試驗(yàn)擬采用重氮化法和碳二亞胺法合成OTC完全抗原,制備并鑒定OTC多抗血清,以期為后期制備OTC單克隆抗體及建立免疫學(xué)快速檢測方法提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    1.1.1 材料與試劑

    土霉素(OTC)、金霉素(CTC)、四環(huán)素(TC)、沙拉沙星(SARA)、環(huán)丙氨嗪(CA)等標(biāo)準(zhǔn)品:純度≥99%,美國Sigma公司;

    1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、對氨基苯甲酸:純度98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;

    弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、牛血清蛋白(BSA)、雞卵清蛋白(OVA):純度≥99%,美國Sigma公司;

    氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉等:分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.1.2 儀器與設(shè)備

    電子天平:ME204E型,梅特勒—托利多儀器有限公司;

    紫外—可見分光光度計(jì):UV-5100H型,美國Thermo Fisher公司;

    電泳儀:DYY-6C型,大連捷邁科貿(mào)有限公司;

    凝膠成像儀:ChemiDocTMXRS+型,美國Bio-Rad公司;

    傅立葉變換紅外光譜儀:NicoletTMiSTM5型,日本島津公司。

    1.1.3 試驗(yàn)動物

    BALB/c小鼠:6周齡SPF級,濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 OTC半抗原合成與鑒定 OTC半抗原合成路線圖見圖2。參照Fleeker等[13]的重氮化法,具體操作步驟為:稱取4.3 mg對氨基苯甲酸溶于4 ℃預(yù)冷的2 mL 0.2 mol/L的稀鹽酸溶液中,稱取4.0 mg NaNO2溶于1 mL 4 ℃預(yù)冷的雙蒸水后緩慢滴加到對氨基苯甲酸溶液中,4 ℃避光反應(yīng)1 h。稱取10 mg OTC溶于2 mL 4 ℃預(yù)冷的四硼酸鈉緩沖液(pH 8.5),將上述反應(yīng)液緩慢滴加到該溶液中,4 ℃避光攪拌2 h,反應(yīng)液呈深紅色,用6 mol/L 的濃鹽酸調(diào)節(jié)其pH至1.5以下,室溫靜置10 min,產(chǎn)生沉淀,5 000 r/min離心3 min,去除上清,用4 ℃預(yù)冷的雙蒸水洗4遍,真空冷凍干燥后取部分樣品進(jìn)行紅外掃描鑒定。

    1.2.2 OTC完全抗原合成 采用同樣的方法合成免疫原OTC-BSA和包被原OTC-OVA,其合成路線(以O(shè)TC-BSA為例)見圖3。具體操作步驟為:稱取OTC半抗原5 mg溶于1 mL PBS中,加入1.8 mg NHS,4 ℃避光反應(yīng)2 h。稱取6.5 mg BSA溶于2 mL PBS后慢滴加到上述反應(yīng)液中,同時加入3 mg EDC,4 ℃避光攪拌24 h。最后在4 ℃條件下用PBS攪拌透析3 d,離心去除沉淀得OTC完全抗原。

    1.2.3 OTC完全抗原鑒定

    (1) 紫外掃描鑒定:用PBS配制與完全抗原溶液濃度一致的BSA溶液和OTC標(biāo)品溶液,用紫外—可見分光光度計(jì)分別掃描其在220~350 nm的吸收光譜,通過對比各溶液的特征吸收峰判斷偶聯(lián)效果[14]。

    (2) 紅外掃描鑒定:將OTC完全抗原溶液真空冷凍干燥,對OTC完全抗原、BSA和OTC進(jìn)行紅外掃描,以掃描波數(shù)為橫坐標(biāo),透過率為縱坐標(biāo),得到紅外掃描光譜并進(jìn)行對比。

    圖2 OTC半抗原合成路線

    圖3 OTC-BSA合成路線圖

    (3) SDS-PAGE鑒定:參照文獻(xiàn)[15]制得12%的分離膠和5%的濃縮膠,其電壓分別為60,90 V,樣品加入量為20 μL(含OTC-BSA 5 μg),用考馬斯亮藍(lán)染液染色6 h,乙酸脫色液脫色6 h,通過凝膠成像系統(tǒng)拍照,對比BSA與OTC-BSA電泳條帶的位置差異判斷偶聯(lián)效果。

    1.2.4 OTC多抗血清的制備與鑒定 選擇4只6周齡的BALB/c小鼠,以30 μg/200 μL/只的劑量背部皮下多點(diǎn)注射免疫4次,每次間隔3周。首次免疫將OTC-BSA與等量FCA混合,后3次為加強(qiáng)免疫,將OTC-BSA與等量FIA混合。免疫完成后10 d斷尾取血,獲得OTC多抗血清。

    (1) OTC多抗血清效價測定:采用間接ELISA法[16]。用CBS將OTC-OVA稀釋并包被于96孔聚苯乙烯板,37 ℃孵育2 h,PBST洗板后加封閉液,37 ℃孵育1 h。向已包被抗原的聚苯乙烯板中加入倍比稀釋的抗體,37 ℃孵育15 min,洗板后加入羊抗鼠酶標(biāo)二抗,37 ℃孵育30 min,洗板后加入顯色液,10 min后終止顯色并讀取OD450 nm值,當(dāng)OD450 nm/空白孔OD450 nm≥2.1時,判定為陽性孔。

    (2) OTC多抗血清敏感性鑒定:采用間接競爭ELISA法[17]。向已包被抗原的聚苯乙烯板中加入效價測定中OD450 nm值為1.0左右的血清稀釋液和具有梯度濃度的OTC標(biāo)品溶液,其他步驟同效價測定操作方法。通過計(jì)算抑制率,以B/B0為縱坐標(biāo)(B為OTC不同濃度的OD450 nm值,B0為OTC零濃度的OD450 nm值),OTC濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制抑制曲線,得到線性回歸方程,并以半數(shù)抑制濃度(IC50)來評定多抗血清敏感性。

    1.2.5 OTC ELISA檢測方法的建立

    (1) 確定最佳包被濃度和工作濃度:將OTC-OVA分別稀釋500,1 000,2 000,4 000,8 000倍進(jìn)行包被,間接ELISA測定各包被濃度下抗體效價,選取效價測定中OD450 nm值1.0左右對應(yīng)的稀釋度作為多抗血清工作濃度,采用間接競爭ELISA測定各包被濃度下IC50,選擇IC50最低一組所對應(yīng)的包被濃度為最佳包被濃度,對應(yīng)的多抗血清稀釋度為最佳工作濃度。

    (2) 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:配置不同濃度的OTC標(biāo)品溶液,并根據(jù)已確定的最佳工作濃度,建立間接競爭ELISA方法。以B/B0為縱坐標(biāo),以O(shè)TC濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    (3) 檢測限(LOD):取不含OTC標(biāo)品的空白樣品,通過建立的間接競爭ELISA方法重復(fù)測定10次,計(jì)算10次OD450 nm值的平均值(X)以及標(biāo)準(zhǔn)差(SD),然后計(jì)算X-2SD,將所得值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程,計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)品濃度,即為檢測限。

    (4) 樣品前處理:將新鮮牛奶樣品,8 000 r/min離心10 min,除去上層脂肪,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    (5) 回收率測定:將OTC標(biāo)準(zhǔn)品加入新鮮牛奶樣品中,使其濃度分別為10,50,100 ng/mL,將加標(biāo)樣品進(jìn)行前處理后,對每個濃度重復(fù)測定4次,根據(jù)所建立方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到測定值,并計(jì)算其回收率。

    (6) 特異性鑒定:選擇CTC、TC、SARA、CA、BSA、OVA作為競爭物,利用所建立的間接競爭ELISA法測定各競爭物對多抗血清的IC50。以O(shè)TC的IC50與各競爭物的IC50的百分比作為交叉反應(yīng)率,交叉反應(yīng)率越低,則特異性越強(qiáng)[18]。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    對所得的數(shù)據(jù)利用Excel 2003進(jìn)行處理(包括回歸分析和顯著性檢驗(yàn)),對分子結(jié)構(gòu)式及合成路線圖用ChemDraw Pro 18.0進(jìn)行繪制。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 OTC半抗原鑒定

    OTC分子結(jié)構(gòu)上含有一個酰胺基和一個活潑酚羥基。有研究[19]從酰胺基考慮,采用戊二醛法和碳二亞胺法使其與載體蛋白偶聯(lián),前期試驗(yàn)同樣采用過此方法,但合成的人工抗原免疫效果差,不能滿足后續(xù)試驗(yàn)需求。采用戊二醛法若不嚴(yán)格控制反應(yīng)物加入順序和反應(yīng)時間,極易發(fā)生分子之間的自聯(lián),從而影響小分子抗原決定簇充分暴露,進(jìn)而影響免疫效果[20]。因此試驗(yàn)從OTC分子上活潑的酚羥基考慮偶聯(lián),首先采用重氮化法合成OTC的半抗原,然后采用紅外掃描(IR)法對OTC半抗原進(jìn)行鑒定。圖4、5分別為OTC和改造后OTC紅外光譜圖,改造后OTC除了含有OTC中原有化學(xué)基團(tuán)外,在1 682.36 cm-1處出現(xiàn)羧基特征吸收峰,在2 360.46 cm-1處出現(xiàn)偶氮鍵特征吸收峰,證明OTC半抗原成功引入羧基基團(tuán)。

    2.2 OTC完全抗原鑒定

    2.2.1 紫外掃描 OTC半抗原改造完成后,采用改進(jìn)碳二亞胺法使其與載體蛋白偶聯(lián),合成完全抗原,首先利用紫外掃描(UV)法對完全抗原進(jìn)行鑒定。OTC-BSA、BSA、OTC的紫外掃描圖如圖6所示,BSA在278 nm處出現(xiàn)特征吸收峰,而OTC-BSA的吸收光譜相比BSA發(fā)生了變化,特征吸收峰稍向左偏移,并未與BSA最大吸收峰重疊,初步說明OTC和BSA發(fā)生偶聯(lián)。

    圖4 OTC紅外光譜圖

    圖5 改造后OTC紅外光譜圖

    圖6 OTC-BSA、BSA、OTC紫外掃描圖

    2.2.2 紅外掃描 采用紅外掃描法對完全抗原進(jìn)行進(jìn)一步鑒定,圖7、8分別為BSA和OTC-BSA紅外光譜圖,合成的完全抗原OTC-BSA在1 652.51 cm-1處出現(xiàn)蛋白質(zhì)中氨基酸的特征峰,在858.05,950.04,1 073.54,1 162.24,1 392.30 cm-1處,出現(xiàn)明顯的OTC特征峰。結(jié)果進(jìn)一步表明完全抗原偶聯(lián)效果良好。

    2.2.3 SDS-PAGE鑒定 圖9為完全抗原OTC-BSA的SDS-PAGE鑒定結(jié)果,OTC-BSA電泳條帶出現(xiàn)明顯拖尾現(xiàn)象,其遷移速率小于BSA,說明OTC-BSA分子量大于BSA,也能夠表明OTC和BSA偶聯(lián)產(chǎn)生了較好的效果。

    圖7 BSA紅外光譜圖

    圖8 OTC-BSA紅外光譜圖

    圖9 OTC-BSA的SDS-PAGE鑒定結(jié)果

    2.3 多抗血清鑒定

    2.3.1 效價測定 表1為OTC多抗血清效價測定結(jié)果,4只免疫小鼠多抗血清效價均達(dá)到1∶12 800,說明偶聯(lián)的免疫原具有較好的免疫效果。

    2.3.2 敏感性鑒定 表2為OTC多抗血清間接競爭ELISA測定結(jié)果,可以看出OTC對4只小鼠多抗血清均起到抑制作用,其中對2號小鼠血清抑制效果最好,其抑制曲線如圖10所示,IC50為40.44 ng/mL,說明多抗血清敏感性良好。

    表1 OTC多抗血清效價測定結(jié)果

    表2 OTC多抗血清間接競爭ELISA測定結(jié)果

    圖10 2號小鼠多抗血清抑制曲線

    2.4 OTC ELISA檢測方法的建立

    2.4.1 最佳包被濃度和工作濃度的確定 表3為OTC-OVA不同包被濃度下2號小鼠多抗血清效價結(jié)果,圖11為OTC-OVA不同包被濃度下抗體的IC50,由表3測量結(jié)果選擇不同包被濃度下抗體工作濃度分別為:1∶2 000,1∶2 000,1∶1 000,1∶1 000,1∶100,并利用間接競爭ELISA測定OTC-OVA不同包被濃度下抗體的IC50,如圖11所示當(dāng)包被原為1∶1 000倍稀釋,抗體為1∶2 000倍稀釋時,其IC50最低,敏感性最好。

    2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 根據(jù)已確定的最佳包被濃度和抗體工作濃度,建立間接競爭ELISA檢測方法并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖12所示。根據(jù)線性回歸方程計(jì)算IC50為32.92 ng/mL。

    2.4.3 檢測限 通過建立的間接競爭ELISA方法測定空白樣品,平行測定10次,OD450 nm分別為0.968,1.003,0.986,1.015,1.101,0.987,0.993,1.031,0.976,1.003,平均值(X)為1.006,標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為0.038,計(jì)算X-2SD值(0.93),再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得LOD為1.3 ng/mL。

    表3 不同包被濃度的效價測定結(jié)果

    圖11 不同包被濃度所對應(yīng)的抗體IC50

    圖12 OTC間接競爭ELISA檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線

    2.4.4 回收率測定 間接競爭ELISA方法測定不同濃度OTC的牛奶樣品結(jié)果如表4所示,回收率在84.70%~87.45%,變異系數(shù)在9.3%~11.5%,變異系數(shù)<15%,說明方法具有良好的準(zhǔn)確度。

    2.4.5 特異性鑒定 ELISA方法的特異性鑒定結(jié)果如表5所示,與CTC、TC的交叉反應(yīng)率分別為5.27%,4.10%,與其他競爭物交叉反應(yīng)率<0.4%,說明所建立的ELISA方法與CTC、TC存在微弱交叉反應(yīng),但與其他獸藥及載體蛋白均無交叉反應(yīng),具有較強(qiáng)的特異性。

    表4 回收率測定結(jié)果

    表5 OTC多抗血清與競爭物的交叉反應(yīng)

    3 結(jié)論

    試驗(yàn)采用重氮化法和碳二亞胺法成功合成OTC的完全抗原,所制備的小鼠多抗血清具有良好的敏感性,在此基礎(chǔ)上初步建立OTC間接競爭ELISA檢測方法,IC50為32.92 ng/mL,LOD為1.3 ng/mL,牛奶樣品中添加回收率在84.70%~87.45%,與CTC、TC的交叉反應(yīng)率分別為6.46%,5.01%,與其他競爭物交叉反應(yīng)率<0.4%,具有良好的檢測效果,可為監(jiān)控OTC殘留提供一定的技術(shù)支撐。

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