β-谷甾醇乙酸酯對脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響

侯麗芬 - 宗珊盈 - 張海臣 -潘 麗 王宏雁 - 谷克仁, -,

(1. 河南工業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，河南 鄭州 450001；2. 鄭州旅游職業(yè)學(xué)院烹飪食品系，河南 鄭州 450009；3. 中檢集團中原農(nóng)食產(chǎn)品檢測〔河南〕有限公司，河南 鄭州 450003；4. 吉林工程職業(yè)學(xué)院糧油食品學(xué)院，吉林 四平 136001；5. 河南工業(yè)大學(xué)化學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001)

近年來，納米脂質(zhì)體用于食品中生物活性物質(zhì)的包封和控釋已成為一種有效的手段。脂質(zhì)體已成功應(yīng)用于包覆抗菌肽[1]、兒茶素[2]、乳鐵蛋白[3]、抗壞血酸[4]、VE[5]和ω-3脂肪酸[6]等生物活性物質(zhì)。脂質(zhì)體通常是由一個或多個磷脂雙分子層包裹一定體積的水相構(gòu)成的囊泡[1, 7]，主要由兩親性物質(zhì)(如磷脂和甾醇等)制備[8]。膽固醇影響天然或合成膜的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)膜的剛性、厚度、穩(wěn)定性和流動性[9-11]。盡管膽固醇可以改善脂質(zhì)體膜的特性，但患有高膽固醇血癥患者應(yīng)避免食用含膽固醇的食物。

植物甾醇有降低膽固醇作用，其結(jié)構(gòu)與膽固醇類似，也含有環(huán)戊烷全氫菲骨架，僅在支鏈甲基和雙鍵上存在差別。目前已有很多研究[12-14]發(fā)現(xiàn)植物甾醇能夠代替膽固醇來構(gòu)建穩(wěn)定的脂質(zhì)體。與植物甾醇相比，植物甾醇酯具有較高的脂溶性，同等或更優(yōu)的生物活性[15-16]，而對于植物甾醇酯摻入脂質(zhì)體中的研究較少。Alexander等[17]采用植物甾醇酯制備大豆磷脂脂質(zhì)體提高了水溶性制劑抗壞血酸的包封率。Wang等[18]采用高壓均質(zhì)法制備植物甾醇和植物甾醇酯大豆磷脂脂質(zhì)體，為傳遞生物活性成分提供了一種實用的方法。然而，關(guān)于植物甾醇酯作為輔助膜材對脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的研究尚未見報道。試驗擬通過薄膜—超聲法制備β-谷甾醇乙酸酯(β-Sitosterol Acetate Ester，SAE)脂質(zhì)體，考察其不同摻入濃度對脂質(zhì)體粒徑、PDI、電位及儲藏穩(wěn)定性的影響，并探究SAE與磷脂在膜中的相互作用，以期為相關(guān)研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

大豆磷脂(SPC)：純度98%，沈陽天峰生物制藥有限公司；

β-谷甾醇(β-Sitosterol，Sito)：純度98%，上海依赫生物科技有限公司；

β-谷甾醇乙酸酯(SAE)：純度97%，實驗室自制；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯仿、甲醇等：分析純。

1.2 儀器

超聲波信號發(fā)生器：HN-500型，上海超聲漢諾儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE52-AA型，上海亞榮生化儀器廠；

真空冷凍干燥機：VFD-2000型，上海比朗儀器制造有限公司；

傅立葉變換紅外光譜儀：PerkinElmer Spectrum TWO型，美國鉑金埃爾默股份有限公司；

激光納米粒度儀：Zetasizer Nano ZS90型，英國馬爾文儀器有限公司；

熱重儀：TGA Q50型，美國TA儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 脂質(zhì)體的制備 分別精密稱取一定量的SPC(80 mg)、tween-80(60 mg)和SAE(Sito)(2，4，6，8 mg)，置于圓底燒瓶中，加入10 mL有機溶劑(體積比為2∶1的三氯甲烷—甲醇溶液，)常溫溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑(控制真空度0.06 MPa，水浴溫度50 ℃)，使壁材在圓底燒瓶壁形成一層均勻透明的薄膜，在真空度0.1 MPa下繼續(xù)旋蒸30 min，注入0.02 mol/L磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4，0.15 mol/L NaCl)10 mL水化脂質(zhì)薄膜10 min。所得乳液在冰浴條件下，探頭超聲(200 W，8 min，脈沖1 s/1 s)，得到呈現(xiàn)淡藍(lán)色乳光的脂質(zhì)體，4 ℃冷藏保存待分析。按相同方法制備不含SAE(Sito)的空白脂質(zhì)體。

1.3.2 脂質(zhì)體的粒徑、多分散指數(shù)(PDI)和電位的測定

用高純水稀釋脂質(zhì)體100倍，采用 Zetasizer Nano ZS90(DLS)測定其平均粒徑、PDI和電位。PDI反映的是脂質(zhì)體粒徑分布情況，范圍為0～1。PDI<0.3，說明脂質(zhì)體呈現(xiàn)較好的單一性分散[19]。樣品測量前，25 ℃下平衡20 s，每個樣品測量3次，每次至少運行10次，數(shù)據(jù)表示為(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。

1.3.3 脂質(zhì)體乳液的儲藏穩(wěn)定性 將制備好的脂質(zhì)體放置于冰箱4 ℃左右，分別選取貯藏0，7，15，21，30 d的樣品，按照1.3.2方法采用DLS測定其粒徑、PDI和電位。

1.3.4 脂質(zhì)體的冷凍干燥 取1.3.1制備的脂質(zhì)體10 mL 于50 mL燒杯中，移入冷凍干燥機，首先在-20 ℃ 預(yù)冷凍4 h，然后在真空度1.0 MPa下，程序控溫保持38 h，得到脂質(zhì)體冷凍產(chǎn)品。

1.3.5 紅外光譜分析 取少量1.3.4制備的冷凍干燥樣品，采用PerkinElmer UATR TWO傅立葉紅外光譜儀，全反射光譜測定法進(jìn)行測定。光譜測定范圍4 000～400 cm-1，儀器分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)16。

1.3.6 熱重(TGA)分析 TGA分析脂質(zhì)體的熱穩(wěn)定性。冷凍干燥樣品加熱溫度范圍40～600 ℃，升溫速率10 ℃/min，氮氣流速60 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 8.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示。采用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 粒徑與PDI

采用薄膜—超聲法制備小單室脂質(zhì)體，SAE的不同摻入量對脂質(zhì)體粒徑和PDI的影響如圖1所示。由圖1可知，隨著SAE摻入量的增加，保持其他成分不變，加入0～6 mg SAE的脂質(zhì)體粒徑無顯著差別(P<0.05)，增加至8 mg時，粒徑顯著增大。PDI隨著SAE摻入量的增加而逐漸增大，其中2 mg和4 mg的PDI無明顯差異，分別為0.22和0.23。試驗中SAE最大添加量8 mg，但是此時得到的脂質(zhì)體粒徑和PDI與對照樣品相比均明顯增大，可能是因為超出了其溶解度而破壞了脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。甾醇酯在磷脂膜中的溶解度很低，Zajicek等[20]報道膽固醇酯在完全水化的磷脂雙層膜中溶解度非常有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于膽固醇。同時，Salmon等[21]研究表明膽固醇酯的最大摻入量隨鏈長的增加而降低，例如蛋黃卵磷脂構(gòu)成的多層膜中膽固醇酯的摻入量從膽固醇辛酸酯摩爾分?jǐn)?shù)的5%到硬脂酸酯摩爾分?jǐn)?shù)的1.4%，但是小單室脂質(zhì)體的最大摻入量比多層膜高1.2～2.0倍。

圖1 SAE摻入量對脂質(zhì)體粒徑和PDI的影響

Figure 1 The effects of SAE incorporation on particle size and polydispersity index of liposome

Sito的不同摻入量對脂質(zhì)體粒徑和PDI的影響如圖2 所示。由圖2可知，隨著Sito摻入量的增加對粒徑無明顯影響，而對PDI值有緩慢增加的趨勢。已有研究[22]表明少量加入Sito對粒徑影響不大，可能是少量Sito的加入填補了磷脂分子間的空隙，而對粒徑無顯著影響。同時Samar等[23]研究得出膽固醇在低濃度下(摩爾分?jǐn)?shù)<5%)未顯現(xiàn)出增強DPPC膜有序性的作用。Sito與膽固醇結(jié)構(gòu)相似，在脂質(zhì)體膜中有相似的作用。

圖2 Sito摻入量對脂質(zhì)體粒徑和PDI的影響

通過對比得出，在添加量為2，4 mg時，SAE和Sito有相似的粒徑和PDI。

試驗中摻入SAE的脂質(zhì)體電位與對照樣品無顯著差異，為-19.1～-20.5 mV。Monica等[24]同樣采用薄膜—超聲法制備了含有膽固醇硬脂酸酯的脂質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體電位有稍微的降低。這一點在試驗中不明顯。

2.2 儲藏穩(wěn)定性

SAE和Sito不同摻入量脂質(zhì)體在4 ℃下放置不同時間的粒徑變化如圖3所示。由圖3(a)看出，在4 ℃下0～15 d，2～4 mg SAE脂質(zhì)體粒徑先增加后減小；15 d后粒徑緩慢增大。而對于6～8 mg SAE脂質(zhì)體來說，放置不同時間后，粒徑均比0 d小，而且無明顯規(guī)律性；這主要是由于此濃度下的脂質(zhì)體在放置過程中出現(xiàn)不同程度的絮狀沉淀(試驗過程中肉眼觀察)，導(dǎo)致樣品取樣不均勻，同時也反映出其儲藏穩(wěn)定性較差。由圖3(b)可知，2～4 mg Sito脂質(zhì)體與相同摻入量的SAE脂質(zhì)體變化一致。而6～8 mg Sito脂質(zhì)體隨著放置時間的延長，粒徑緩慢增大，但無沉淀出現(xiàn)，與楊斌等[25]的研究結(jié)果相一致。

SAE和Sito不同摻入量脂質(zhì)體在4 ℃下放置不同時間的PDI變化如圖4所示。SAE摻入量為2，4 mg的脂質(zhì)體PDI變化與Sito摻入量為2～8 mg的脂質(zhì)體PDI變化一致，呈現(xiàn)先降低然后增加的趨勢；且放置21 d后，均低于未摻入SAE和Sito的脂質(zhì)體。而6～8 mg SAE脂質(zhì)體的PDI由于放置過程中出現(xiàn)沉淀導(dǎo)致檢測樣品不均勻，因此無參考價值。

在4 ℃下儲藏，與Sito脂質(zhì)體相比較，SAE脂質(zhì)體摻入量為2，4 mg的粒徑變化較小，在30 d內(nèi)可以保持較好的粒度分布性，說明其具有較好的儲藏穩(wěn)定性。

2.3 紅外光譜分析

經(jīng)過冷凍干燥的SAE和Sito脂質(zhì)體紅外光譜見圖5。波數(shù)2 925 cm-1和2 850 cm-1分別與CH2不對稱伸縮振動和對稱伸縮振動有關(guān)，表明脂質(zhì)膜雙層?；湹淖兓痆26]。由表1可知，少量SAE和Sito的摻入并未與酰基鏈發(fā)生明顯作用，同時與膜的界面羰基水化狀態(tài)有關(guān)的C═O對稱伸縮振動峰(V C═O)也未發(fā)生明顯變化。但是，空白脂質(zhì)體的P═O反對稱伸縮振動峰(Vas P═O)為1 246 cm-1，而SAE脂質(zhì)體遷移至1 241(2 mg)，1 245(4 mg) cm-1，Sito脂質(zhì)體遷移至1 243(2 mg)，1 245(4 mg)cm-1。同時，可以看到P═O對稱伸縮振動峰(Vs P═O)，從空白脂質(zhì)體的1 096 cm-1移至SAE脂質(zhì)體的1 088，1 094 cm-1，Sito脂質(zhì)體移至1 089，1 092 cm-1，且相應(yīng)的峰強度也發(fā)生了變化。Vas P═O和Vs P═O降低說明脂質(zhì)體與外來物質(zhì)間的氫鍵增強了[27]。與Sito脂質(zhì)體不同的是 (CH3)3N對稱伸縮峰[V(CH3)3N]，SAE脂質(zhì)體由968 cm-1變?yōu)?70 cm-1(2 mg)和965 cm-1(4 mg)；而Sito脂質(zhì)體無明顯變化，丁武孝等[28]也研究發(fā)現(xiàn)膽固醇的羥基與季銨基團無靜電作用。

圖3 SAE和Sito摻入脂質(zhì)體在4 ℃下放置

Figure 3 The effects of incorporation of SAE and Sito on particle size of liposomes at 4 ℃ at different times

圖4 SAE和Sito摻入脂質(zhì)體在4 ℃下放置

Figure 4 The effects of SAE and Sito incorporation on polydispersity index of liposomes placed at 4 ℃ at different times

由上可知，SAE摻入脂質(zhì)體中與磷脂的P═O和(CH3)3N之間有明顯相互作用，而Sito僅與磷脂的P═O產(chǎn)生氫鍵。氫鍵的形成說明摻入物質(zhì)與磷脂在脂質(zhì)膜中結(jié)合緊密，有利于膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[29]。

圖5 SAE摻入脂質(zhì)體的紅外圖譜

圖6 Sito摻入脂質(zhì)體的紅外圖譜

表1 不同脂質(zhì)體對應(yīng)的紅外特征峰的波數(shù)

2.4 熱重分析

采用熱重法(TGA)測定冷凍干燥后SAE、Sito和未摻入脂質(zhì)體經(jīng)歷高溫的物理化學(xué)變化，如圖7所示。熱重分析結(jié)果顯示，未摻入脂質(zhì)體最后剩余質(zhì)量的48.0%；2，4 mg SAE脂質(zhì)體分別為46.4%和46.7%；Sito脂質(zhì)體為47.1%，無顯著差異(P<0.05)。圖7中顯示了不同脂質(zhì)體的降解曲線，第一階段重量的減少主要與樣品中含有水分和揮發(fā)性物質(zhì)有關(guān)[30-31]，未摻入脂質(zhì)體減少2.5%、2 mg SAE和4 mg SAE脂質(zhì)體分別減少為3.4%和3.7%、4 mg Sito脂質(zhì)體減少1.8%。在較高速率降解階段，2，4 mg SAE脂質(zhì)體分別在187～358，218～337 ℃時，穩(wěn)定性高于未摻入脂質(zhì)體；4 mg Sito脂質(zhì)體在183～314 ℃時，穩(wěn)定性高于未摻入脂質(zhì)體。這是由于摻入SAE和Sito能使脂質(zhì)體極性基團的氫鍵增強。張繼芬等[29]也發(fā)現(xiàn)外來物質(zhì)與磷脂形成氫鍵后會一定程度提高脂質(zhì)體的熱穩(wěn)定性。

圖7 SAE、Sito和未摻入脂質(zhì)體的TGA分析

3 結(jié)論

試驗將SAE摻入大豆磷脂脂質(zhì)體中，考察其對所構(gòu)建的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響。研究證明低摻入量的SAE脂質(zhì)體粒度分布均勻，微觀形貌較好，且具有較好的儲藏穩(wěn)定性。少量添加SAE與膜中磷脂分子極性頭基形成氫鍵，提高了脂質(zhì)體的熱穩(wěn)定性，起到了與Sito相似的穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)的作用。SAE保留了Sito大部分的官能團，摻入脂質(zhì)體中還可能會引起脂質(zhì)體的抗氧化性、包埋和釋放性能的改變，因此，需要進(jìn)一步開展相關(guān)的研究。