HPLC法測定大花胡麻草不同部位中2種環(huán)烯醚萜苷成分含量

張傳利 趙 秀 朱春梅 李維峰 馬 曉 杜華波 何素明

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院，云南 普洱 665099

大花胡麻草(CentrantheragrandifloraBenth.)又稱紅根野蠶豆、野蠶豆根[1]，是胡麻草屬草本植物，與地黃、玄參等中藥材同屬于玄參科(Scrophulariaceae)[2-3]，始載于《中華本草》，在云南、廣西、貴州等民間常將其根用于治療閉經(jīng)，痛經(jīng)、崩漏、小兒高熱、尿血、不孕癥、跌打損傷、外傷出血及風(fēng)濕骨痛[4]，在開發(fā)治療心血管疾病、白血病、利尿、降壓、降糖、保肝等方面新型藥物及保健食品有很好的前景[5]。大花胡麻草根中含有杜鵑紅素、甘露醇以及多種環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)[6-7]，環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)藥用價值很高，是一類在自然界廣泛分布的天然產(chǎn)物，具有消炎、抗癌、防衰老、抗氧化、降血糖、強(qiáng)心、免疫調(diào)節(jié)活性等多種藥理活性[8]。大花胡麻草作為玄參科家族的一員，國內(nèi)外對其研究較少，主要是集中在對大花胡麻草根的化學(xué)成分鑒定及部分成分的活性研究方面[1-3,7,9],而對根部以外的其他部位研究及各部位中的有效成分的含量研究還未見報(bào)道?；诖?，本試驗(yàn)運(yùn)用HPLC測定栽培大花胡麻草中2種環(huán)烯醚萜苷的含量，以期探討梓醇和桃葉珊瑚苷在栽培大花胡麻草中的含量分布，為其藥用部位選擇、不同藥物和保健食品開發(fā)提供參考。

1 試劑與儀器

1.1 試劑 大花胡麻草新鮮樣品：采自于云南省紅河州屏邊縣，經(jīng)普洱市民族醫(yī)藥研究所張紹云主任藥師鑒定為玄參科胡麻草屬植物大花胡麻草(CentrantheragrandifloraBenth.)的根、莖、葉、花；桃葉珊瑚苷(純度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為A117980-25 mg)與梓醇(純度≥97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為 C110216-100 mg)對照品；乙腈(色譜純，德國 MERCK)、甲醇(色譜純，德國MERCK)、磷酸(分析純)，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器 安捷倫1200高效液相儀(安捷倫科技有限公司)；SK5200H型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；CN61M/DZF真空干燥箱(上海奧豪斯貿(mào)易有限公司)、ME204E電子分析天平(上海奧豪斯貿(mào)易有限公司)；純水/超純水系統(tǒng)(韓國HUMAN PowerI)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱定桃葉珊瑚苷、梓醇對照品1.08 mg、1.23 mg，至10 mL棕色容量瓶中，加各自流動相定容，搖勻，制成0.108 mg/mL的桃葉珊瑚苷溶液和0.123 mg/mL的梓醇溶液。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱量根、莖、葉、花等部位樣品和混合樣(根莖葉質(zhì)量比1∶1∶1)粉末0.5 g置于具塞錐形瓶中，精密加入40%甲醇5 mL，搖勻并稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率35 kHZ)30min，靜置5 min，用40%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，吸取溶液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過[10]，即得。

2.3 HPLC測定桃葉珊瑚苷和梓醇分析條件 桃葉珊瑚苷、梓醇測定色譜柱分別為Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、SPHERI-5RP-18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相分別為乙晴-水(3∶97)、甲醇-0.1%磷酸水(1∶99)；檢測波長分別為205 nm、210 nm；流速均為1 mL/min；進(jìn)樣量均為20 uL；柱溫分別為25℃、35℃。桃葉珊瑚苷、梓醇HPLC色譜圖見圖1、2。結(jié)果表明，在此條件下，桃葉珊瑚苷保留時間約為 12.5 min，供試品溶液色譜圖在對照品溶液保留時間處有相同色譜峰，且與相鄰峰分離度符合要求。

2.4 線性關(guān)系考察 配制梓醇對照品溶液：0.0615、0.09225、0.123、0.15375、0.1845、0.5535、1.107 mg/mL；桃葉珊瑚苷對照品溶液：0.0036、0.036、0.072、0.108、0.144、0.180、0.216 mg/mL。在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以對照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]，得桃葉珊瑚苷、梓醇回歸方程分別為Y=16899435.76X+1357.21(r=0.9999)、Y=7097432.22X+3001.34(r=0.9999)。結(jié)果表明，分別在3.6～216.0 μg/mL、61.5～1107.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1”對照品溶液20 μL，分別在“2.3”項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，測峰面積，計(jì)算各峰面積RSD。得梓醇、桃葉珊瑚苷峰面積RSD分別為0.67%、0.64%，表明儀器具有良好精密度。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取栽培大花胡麻草各部位和混合樣粉末各6份，每份約0.5 g，精密稱定，在“2.2”項(xiàng)下配制后依次進(jìn)樣，在“2.3”項(xiàng)下測定。得根、葉、花、混合樣梓醇平均含量分別為0.1557、10.8382、1.851、0.7256 mg/g，梓醇含量的RSD分別為1.85、0.14、0.66、0.85%；得根、莖、葉、花、混合樣桃葉珊瑚苷平均含量分別為0.9297、0.0398、0.3903、0.00382、0.3195 mg/g，葉珊瑚苷含量的RSD分別為0.73、1.02、0.66、1.97、0.94%。表明所建立方法具有良好的重復(fù)性。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取栽培大花胡麻草根供試品，在“2.2”項(xiàng)下配置0、2、4、8、12、24 h后依次進(jìn)樣，分別考察梓醇和桃葉珊瑚苷的穩(wěn)定性。得梓醇、桃葉珊瑚苷峰面積RSD分別為0.48%、0.74%，表明在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份同批樣品粉末約0.25 g，同時精密加入梓醇對照品0.3 mL(0.123 mg/mL)、桃葉珊瑚苷對照品2.2 mL(0.108 mg/mL)，分別按“2.3”項(xiàng)色譜條件下測定。得梓醇、桃葉珊瑚苷平均回收率分別為99.87%、99.88%；RSD分別為0.61%、0.42%，具體結(jié)果見表1。

表1 梓醇和桃葉珊瑚苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.9 樣品含量測定 取大花胡麻草各部位和混合樣樣品各約0.5 g，平行6份，按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)下測定，分別吸取各樣品20 μL，計(jì)算各部位樣品含量。具體結(jié)果和含量比較見表2、圖3。

由表2和圖3可知，在栽培大花胡麻草植株中，桃葉珊瑚苷在各部位均有分布，以根中最高，且與其他部位間存在顯著差異；梓醇在根、葉、花等部位中有分布，在莖中未檢出，以葉中最高，檢出各部位間均存在顯著差異。

表2 栽培大花胡麻草根、莖、葉、花中梓醇和桃葉珊瑚苷含量測定結(jié)果

注:數(shù)據(jù)后字母表示P<0.05水平的差異顯著性;“-”表示未檢測到該部位含量。

3 結(jié)論與討論

大花胡麻草為環(huán)烯醚萜苷類化合物來源的一類天然產(chǎn)物資源，從表2和圖3可知，梓醇和桃葉珊瑚苷在栽培大花胡麻草各部位中幾乎均有分布，但不同部位間的含量卻存在顯著差異，2種環(huán)烯醚萜苷活性成分在植株內(nèi)分布規(guī)律也不一致，梓醇在植物內(nèi)的含量表現(xiàn)為：葉>花>混合樣>根，栽培葉中含量高達(dá)10.838 mg/g，是其它部位的5.9～69.5倍，且葉中梓醇含量是藥典規(guī)定最低含量的5.4倍以上；桃葉珊瑚苷在植物體內(nèi)的含量表現(xiàn)為：根>葉>混合樣>莖>花，栽培根中含量最高為0.930 mg/g，是其它部位的2.4～232.5倍。近從梓醇和桃葉珊瑚苷兩種活性成分在栽培大花胡麻草植株內(nèi)分布和含量分析結(jié)果可初步得出云南民間習(xí)慣以根入藥和作為產(chǎn)品開發(fā)的部位從不同物質(zhì)功效和治療效果上在一定程度上是不合理的，且除根以外的其他部位可根據(jù)不同功效需求來開發(fā)不同的產(chǎn)品，是可以合理利用，如花中含量微量的桃葉珊瑚苷可以作為開發(fā)花茶的原料；另外，根、莖、葉按質(zhì)量1∶1∶1的比例混合樣中桃葉珊瑚苷和梓醇含量均適宜，適合用于開發(fā)復(fù)合功效產(chǎn)品的原料。

本實(shí)驗(yàn)只分析比較了來源同一產(chǎn)地的栽培大花胡麻草不同部位中梓醇和桃葉珊瑚苷的含量差異，但不同生態(tài)環(huán)境對生物活性成分的有效積累影響較大，其他產(chǎn)地和不同栽培條件下栽培大花胡麻草中梓醇和桃葉珊瑚苷的含量是否在植株內(nèi)符合本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，需要進(jìn)一步研究。

本研究測定并分析比較了栽培大花胡麻草中2種環(huán)烯醚萜苷的含量，得到了梓醇和桃葉珊瑚苷在栽培大花胡麻草植株內(nèi)的含量和分布規(guī)律，并在參照《中國藥典》(2015年版，一部)[12]中高效液相色譜法的基礎(chǔ)上對提取溶劑、溶劑濃度和流動相分離比例進(jìn)行篩選和優(yōu)化，建立了分離效果較好的色譜條件，為今后有效測定栽培大花胡麻草中環(huán)烯醚萜苷類活性成分提高一定的科學(xué)依據(jù)，且在精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率等指標(biāo)方面均表現(xiàn)良好，也為今后該天然產(chǎn)物資源質(zhì)量控制提供一定參考。