基于流式細(xì)胞術(shù)的淋巴細(xì)胞亞群分類試驗(yàn)條件比較

姜華，文海若，劉麗，顏玉靜，霍艷

基于流式細(xì)胞術(shù)的淋巴細(xì)胞亞群分類試驗(yàn)條件比較

姜華*，文海若*，劉麗，顏玉靜，霍艷

100176 北京，中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價(jià)監(jiān)測中心藥物非臨床安全評價(jià)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

比較不同抗體稀釋度和多聚甲醛濃度對流式細(xì)胞術(shù)測定淋巴細(xì)胞亞群分類結(jié)果的影響。

取猴抗凝全血經(jīng)濃度為 1% 或 4% 的多聚甲醛固定后連續(xù)4 d 上機(jī)測定淋巴細(xì)胞熒光強(qiáng)度及 CD3+、CD4+、CD8+、CD20+百分率及 CD4+/CD8+比值。取猴抗凝全血 50 μl 分別與1、3、5 和 10 μl CD8+-FITC、CD4+-PE、CD3+-PerCP 抗體混合后連續(xù) 7 d 上機(jī)測定 CD4+和 CD8+熒光強(qiáng)度及 CD4+與 CD8+百分率和 CD4+/CD8+比值。

經(jīng) 1% 多聚甲醛固定至第 4 天檢測雄性動物 CD4+、CD8+、CD3-CD20+百分率和雌性動物 CD8+百分率與樣本制備當(dāng)天相比存在顯著性差異（< 0.05，< 0.01），且存在時(shí)間依賴性。樣本保存至第 4 天時(shí)以 1% 多聚甲醛保存的樣本 CD4+、CD8+、CD3-CD20+百分率與 4% 多聚甲醛保存的樣本相比亦存在顯著性降低（< 0.05，< 0.01，< 0.001）。50 μl 抗凝全血中添加 1 μl 抗體時(shí)，自制備后第 4 天起CD4+平均熒光強(qiáng)度即顯著降低（< 0.01）。所有樣本至第 4 天起，CD4+及 CD8+平均熒光強(qiáng)度顯著性衰減（< 0.01）。

不同多聚甲醛使用濃度、抗體用量及保存時(shí)間均對樣本的狀態(tài)和試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定影響。如流式樣本當(dāng)天無法測定，樣本可于4% 濃度的多聚甲醛中穩(wěn)定保存至制備后第 4 天檢測；在 50 μl 全血中應(yīng)添加至少 3 μl 抗體用于檢測，以保證流式細(xì)胞儀對淋巴細(xì)胞表型識別的靈敏度，檢測應(yīng)于樣本制備后 3 天內(nèi)完成。

流式細(xì)胞術(shù)； 抗體； 淋巴細(xì)胞亞群分類； 食蟹猴； 多聚甲醛

生物制品的潛在免疫毒性風(fēng)險(xiǎn)不可小覷[1]。CD28 超級激活劑 TGN1412 在臨床試驗(yàn)中曾出現(xiàn)多臟器衰竭甚至昏迷的嚴(yán)重毒性反應(yīng)[2]，受到社會廣泛關(guān)注，故在非臨床安全性評價(jià)階段有必要完善免疫毒性評價(jià)。使用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）對淋巴細(xì)胞亞群，如 CD3+、CD4+、CD8+等指標(biāo)進(jìn)行檢測，已成為生物制品安全性研究及評價(jià)中常規(guī)而重要的免疫毒性評價(jià)指標(biāo)。淋巴細(xì)胞根據(jù)表面標(biāo)志的不同分為 T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞等，而 T 淋巴細(xì)胞分為輔助和殺傷細(xì)胞亞群，在 HIV 或其他免疫性疾病的診斷、預(yù)后等都起著很重要的作用[3]。FCM 被認(rèn)為是血液中淋巴細(xì)胞免疫表型分析的標(biāo)準(zhǔn)方法，其原理為表達(dá)不同表面抗原的淋巴細(xì)胞結(jié)合不同熒光抗體，被特定的激光激發(fā)后，收集不同的熒光和散射光信號對細(xì)胞進(jìn)行分析計(jì)數(shù)[4]。與免疫組化檢測法相比，F(xiàn)CM 靈敏度高且更客觀，更適宜對某一指標(biāo)作定量檢測[5]。然而，流式樣本制備過程中多種因素可能對其結(jié)果產(chǎn)生干擾。如抗體組合的選擇[6]、抗體稀釋比例、固定液多聚甲醛的濃度[7]、血樣放置時(shí)間、保存溫度、抗凝劑的選擇[8]等。保證試驗(yàn)條件的一致性及可靠性，是對受試物免疫毒性作出客觀評價(jià)的基石[9]，也是確保免疫毒性的評價(jià)符合藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范（good laboratory practice，GLP）的前提。

食蟹猴為生物技術(shù)藥物臨床前安全性評價(jià)常用動物模型，本研究采集食蟹猴血樣比較不同濃度多聚甲醛（1% 和 4%）以及不同抗體與全血稀釋濃度（1:50、3:50、5:50 和 10:50）對外周血淋巴細(xì)胞亞群分類結(jié)果的影響，以確立多聚甲醛使用濃度和全血稀釋度的最優(yōu)條件，為淋巴細(xì)胞亞群分類流式檢測條件的優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 普通級食蟹猴共 34 只，雌雄各半，購入時(shí) 3 ~ 4 歲，購自廣西雄森靈長類實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖開發(fā)有限公司。動物生產(chǎn)許可證號 SCXK（桂）2011-0002 和 SCXK（桂）2016-0001。飼養(yǎng)于普通級動物房不銹鋼籠具內(nèi)，單籠飼養(yǎng)。動物自由飲水，每只動物每天定量給料和水果各 150 g，自由攝取。食蟹猴飼養(yǎng)于恒溫（16 ~ 26 ℃）、恒濕（40% ~ 70%）的條件下，明暗周期為 12 h，每小時(shí)最低換氣次數(shù) 8 次。所有研究方案均通過國家藥物安全評價(jià)監(jiān)測中心實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會（IACUC）的倫理審查。

1.1.2 主要試劑和儀器 流式儀校準(zhǔn)微球（BD CalibriteTM3-color、APC bead）、流式檢測抗體FITC-CD8（Clone RPA-T8，批號：37124）、PE-CD4（Clone L200，批號：17206）、PerCP-CD3（Clone SP34-2，批號：2230514）、APC-CD20（Clone 2H7）均購自美國 BD 公司；紅細(xì)胞裂解液主要成分：氯化氨（批號：20080228）、碳酸氫鉀（批號：F20101109）、乙二胺四乙酸二鈉（批號：20100324）和多聚甲醛（批號：20111121）購自國藥集團(tuán)；磷酸鹽緩沖液（批號：AD2016267、AD22391274）購自美國 Hyclone 公司；多聚甲醛使用前經(jīng) PBS 稀釋為 1% 或 4% 的應(yīng)用液。

FACSCalibur 流式細(xì)胞儀和分析軟件 Cell QuestTM為美國 BD 公司產(chǎn)品；H-500FRS 高速離心機(jī)為日本Kokusan 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 流式樣本制備方法 將CD8+-FITC、CD4+-PE、CD3+-PerCP 抗體組合與 50 μl 抗凝全血加入流式管中，混勻樣本后于室溫、避光條件下孵育 30 min。在流式管中分別加入 1 ml 的紅細(xì)胞裂解液并混勻，紅細(xì)胞充分裂解后，以 200 ×離心 5 min，棄上清并加入 1 ml PBS，之后再次以 200 ×離心 5 min 棄上清。當(dāng)日樣本在采集后4 h 之內(nèi)完成制備。

1.2.2 比較不同濃度多聚甲醛對結(jié)果的影響 取 24 只猴（雌雄各半）肝素抗凝全血 50 μl，分別與 5 μl CD8+-FITC、CD4+-PE、CD3+-PerCP 抗體混合，每組平行設(shè)置空白對照。流式樣本制備方法同 1.2.1，樣本分別經(jīng)濃度為 1% 或 4% 的多聚甲醛溶液固定，制備后于 2 ~ 8 ℃保存。連續(xù)4 d 上機(jī)測定淋巴細(xì)胞熒光強(qiáng)度及 CD3+、CD4+、CD8+、CD20+百分率及 CD4+/CD8+比值。

1.2.3 比較不同體積抗體與全血混合后對結(jié)果的影響 取 10 只食蟹猴（雌雄各半）肝素抗凝全血 50 μl，分別與 1、3、5 和 10 μl CD8+-FITC、CD4+-PE、CD3+-PerCP 抗體混合，每組平行設(shè)置同型對照。流式樣本制備方法同 1.2.1，樣本使用濃度為 1% 的多聚甲醛溶液固定，制備后于 2 ~ 8 ℃保存。連續(xù) 7 d 上機(jī)測定 T 淋巴細(xì)胞 CD4+和 CD8+熒光強(qiáng)度及 CD4+與 CD8+百分率和 CD4+/CD8+比值。不同樣本抗原表達(dá)的熒光強(qiáng)度經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理，得出平均熒光強(qiáng)度（median fluorescence intensity，MFI）后再進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 多聚甲醛濃度對淋巴細(xì)胞亞群分類結(jié)果的影響

多聚甲醛主要用于固定保存細(xì)胞的原有組織形態(tài)，通常使用濃度為 1%，其高濃度通常使用 4%。樣本經(jīng)濃度為1% 或 4% 的多聚甲醛固定后，分別在制備后連續(xù) 4 d 測定其 CD3+%、CD4+%、CD8+%、CD4+/CD8+及 CD3-CD20+%。樣本經(jīng) 1% 多聚甲醛固定至第 4 天檢測可見雄性動物 CD4+%、CD8+%、CD3-CD20+% 和雌性動物 CD8+% 數(shù)值與樣本制備當(dāng)天的相應(yīng)數(shù)值相比存在顯著性差異（表1，< 0.05，< 0.01），且變化存在時(shí)間依賴性。而以 4% 多聚甲醛固定的樣本制備后連續(xù) 4 d 各項(xiàng)檢測指標(biāo)與制備當(dāng)天相比均未見顯著性變化。此外，樣本保存至第 4 天時(shí)以 1% 多聚甲醛保存的樣本 CD4+%、CD8+%、CD3-CD20+% 數(shù)值與 4% 多聚甲醛保存的樣本相比亦存在顯著性降低（< 0.05，< 0.01，< 0.001）。上述結(jié)果提示多聚甲醛濃度對檢測結(jié)果存在一定影響：1% 多聚甲醛固定樣本最多可保存 3 d 進(jìn)行檢測，而多聚甲醛濃度為 4% 時(shí)在樣本制備后 4 d 使用流式計(jì)數(shù)對不同表面抗原淋巴細(xì)胞作分選，仍可獲得穩(wěn)定數(shù)值。

表 1 樣本經(jīng) 1% 或 4% 多聚甲醛保存不同天數(shù)后對結(jié)果的影響（）

注：與第 1 天的結(jié)果進(jìn)行比較，*< 0.05，**< 0.01；與相同組別經(jīng) 1% 多聚甲醛固定樣本數(shù)據(jù)比較，#< 0.05，##< 0.01，###< 0.001。

Notes: Comparing with the data on the first day,*< 0.05,**< 0.01; Comparing with samples of the group fixed with 1% paraformaldehyde,#< 0.05,##< 0.01,###< 0.001.

表 2 全血中添加不同量抗體測定食蟹猴淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果（）

注：與相同檢測時(shí)長稀釋比例為 10:50 的相應(yīng)指標(biāo)比較，**< 0.01，***< 0.001；與不同檢測時(shí)間相同稀釋比例指標(biāo)比較，##< 0.01。

Notes: Comparing with samples using antibodies diluted in 10:50 and tested at the same time point,**< 0.01,***< 0.001; Comparing with samples at the same antibodies dilutions but tested at different time points,##< 0.01.

2.2 不同抗體稀釋比例對淋巴細(xì)胞亞群分類結(jié)果的影響

使用流式法作淋巴細(xì)胞亞群分類計(jì)數(shù)時(shí)，建議于 50 μl 抗凝全血中添加 10 μl 抗體。本研究分別比較在 50 μl 抗凝全血中添加 10、5、3 和 1 μl 抗體對CD4+及 CD8+平均熒光強(qiáng)度的影響，從而判斷抗體稀釋濃度差異是否對檢測的靈敏度產(chǎn)生影響。樣本經(jīng) 1% 的多聚甲醛固定后連續(xù) 7 d 使用流式細(xì)胞儀檢測（表 2），自制備第4天起，50 μl 抗凝全血中添加1 μl 的全血樣本CD4+平均熒光強(qiáng)度與當(dāng)天制備的添加 10 μl 抗體的全血的樣本相比存在顯著性差異（< 0.01，< 0.001）。此外，所有樣本至第 4 天起，CD4+及 CD8+平均熒光強(qiáng)度出現(xiàn)顯著衰減（< 0.01），抗體用量越少，衰減程度越高。上述結(jié)果提示為保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，50 μl 全血中至少應(yīng)添加 3 μl 抗體用于流式檢測，樣本制備后應(yīng)于 3 d 內(nèi)完成檢測。

樣本經(jīng)不同稀釋比例的抗體處理后，分別在處理當(dāng)天及處理后2 ~ 7 d 測定其CD4+%、CD8+%和 CD4+/CD8+比值（表 3）。不同稀釋比例的抗體保存不同時(shí)間后上述指標(biāo)的測定結(jié)果未見顯著性差異。

3 討論

免疫系統(tǒng)涉及多個(gè)器官，包括胚胎器官、胸腺、淋巴結(jié)、脾、骨髓等，在發(fā)育過程中呈終生不斷更新的狀態(tài)，故對生物技術(shù)藥的免疫毒性進(jìn)行評價(jià)是重點(diǎn)也是難點(diǎn)[9]。非人靈長動物的生物學(xué)特征與人類最為接近，尤其是各項(xiàng)免疫系統(tǒng)指標(biāo)與人體數(shù)據(jù)的可比性最強(qiáng)，成為生物技術(shù)藥物臨床前安全性評價(jià)的重要實(shí)驗(yàn)動物[10]。取動物外周血對其淋巴細(xì)胞亞群分類計(jì)數(shù)，從而對動物免疫細(xì)胞的形態(tài)特征進(jìn)行動態(tài)監(jiān)控并對免疫功能做出評價(jià)，已成為常規(guī)而必備的免疫毒性評價(jià)指標(biāo)。尤其是 T 細(xì)胞淋巴亞群，對藥物的早期藥效或毒性有提示作用，其在安評領(lǐng)域中的應(yīng)用愈發(fā)受到重視。然而多種因素均可對流式細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果產(chǎn)生影響，從而影響結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。如不同廠家及型號流式細(xì)胞儀和動物來源均可能對淋巴細(xì)胞亞群分析產(chǎn)生影響[11-14]。此外，不同抗凝劑及用量[8]、樣本放置時(shí)間[15]及溫度等因素，可能對檢測的靈敏度、表面抗原破壞程度或熒光衰減程度產(chǎn)生影響。屈雪琪等[8]分別在樣本制備后 1 ~ 10 d 內(nèi)使用 FCM 測定經(jīng)肝素、EDTA 和枸櫞酸鈉抗凝的樣本的 CD3+、CD4+及 CD8+數(shù)值后發(fā)現(xiàn)，三種抗凝劑中肝素的抗凝效果最優(yōu)，應(yīng)于樣本制備后4 d 內(nèi)完成檢測。

本研究發(fā)現(xiàn)不同多聚甲醛使用濃度、抗體用量及保存時(shí)間均對樣本的狀態(tài)和試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定影響。多聚甲醛是最常用的組織樣本固定液，甲醛可促使蛋白質(zhì)的氨基之間交聯(lián)形成羧甲基，固定抗原決定簇的三維構(gòu)象，從而發(fā)揮固定細(xì)胞表面蛋白的作用[16]。因甲醛可經(jīng)氧化變?yōu)榧姿?，從而酸化樣本影響染色效果[17]，故樣本制備后應(yīng)盡快檢測。結(jié)果顯示，雖然 1% 和 4% 的多聚甲醛在檢測當(dāng)天的效果相當(dāng)，但流式樣本當(dāng)天無法測定，可適當(dāng)提高多聚甲醛濃度。樣本可于4% 濃度的多聚甲醛中在4 ℃條件下保存至制備后第 4 天檢測，其固定效果較 1% 濃度的多聚甲醛更為穩(wěn)定。此外，本研究數(shù)據(jù)提示樣本制備時(shí)，在 50 μl 全血中應(yīng)添加至少 3 μl 抗體用于檢測，以保證流式細(xì)胞儀對淋巴細(xì)胞表型識別的靈敏度，檢測應(yīng)于樣本制備后 3 d 內(nèi)完成。流式檢測抗體用量尚存爭議，建議實(shí)際工作中使用說明書中抗體推薦量。本研究對正常食蟹猴的淋巴細(xì)胞表型檢測結(jié)果進(jìn)行對比研究，因不存在外源性毒性引起的免疫毒性，動物樣本中淋巴細(xì)胞數(shù)量較多，熒光抗體標(biāo)記分類明顯；當(dāng)樣本中淋巴細(xì)胞含量較低時(shí)，則應(yīng)慎重降低抗體使用量。本研究使用抗體-熒光素組合為 PE-CD4+/FITC-CD8+，PE 為流式細(xì)胞儀較強(qiáng)通道（激光器激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為 480 nm 和 578 nm）[18]，而 CD4+為強(qiáng)表達(dá)抗原，兩者結(jié)合使用進(jìn)一步強(qiáng)化 CD4+信號，本研究條件下發(fā)現(xiàn) PE-CD4+數(shù)值對外在因素的改變較 FITC-CD8+敏感。樣本經(jīng) 1% 多聚甲醛固定后，抗體稀釋度對樣本的熒光強(qiáng)度影響較大。保存時(shí)間過久或抗體稀釋度過低，可影響抗體與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合度，進(jìn)而對熒光強(qiáng)度產(chǎn)生影響，故建議所有樣本盡量于制備當(dāng)天測定。

表 3 使用不同比例稀釋抗體測定食蟹猴 T 淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果（）

綜上所述，試驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)室操作技術(shù)及操作程序等多種環(huán)節(jié)均可對淋巴細(xì)胞亞群分類結(jié)果產(chǎn)生影響，為保證獲得科學(xué)而有效的研究數(shù)據(jù)，有必要在 GLP 工作中不斷積累經(jīng)驗(yàn)，完善樣本制備的過程，并嚴(yán)格控制儀器條件設(shè)置及測定時(shí)間等流程，盡量減少各種對于流式測定結(jié)果的影響[6,18]。本研究為不同淋巴細(xì)胞亞群分類流式檢測條件的可信度提供數(shù)據(jù)支持。

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Comparison of lymphocyte subsets classification assay conditions based on flow cytometry

JIANG Hua, WEN Hai-ruo, LIU Li, YAN Yu-jing, HUO Yan

Author Affiliation: Key Laboratory of Beijing for Nonclinical Safety Evaluation Research of Drugs, National Center for Safety Evaluation of Drugs, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100176, China

To evaluate the effects of the dilution of antibody and the concentration of paraformaldehyde on the classification results of lymphocyte subsets detected by flow cytometry.

50 μl anti-coagulant whole blood was taken from monkeys and fixed with 1% and 4% paraformaldehyde, and then the fluorescence intensity of T lymphocytes, the percentage of CD3+, CD4+, CD8+and CD20+and CD4+/CD8+were detected by flow cytometry for four days. 50 μl anti-coagulant whole blood was taken from monkeys and mixed with 1, 3, 5 and 10 μl CD8+-FITC, CD4+-PE, CD3+-PerCP antibody respectively, and then the CD4+and CD8+fluorescence intensity of T lymphocytes, the percentage of CD4+and CD8+and CD4+/CD8+were detected by flow cytometry for seven days.

The detection results of the fourth day after preparation of the samples fixed with 1% paraformaldehyde showed that, the percentage of CD4+%, CD8+% and CD3-CD20+% cells from the male animals, and the percentage of CD8+% cells of the female animals were significantly different from that on the day of sample preparation (< 0.05 and< 0.01, respectively) with time-dependent effect. CD4+%, CD8+%, CD3-CD20+% cells in the samples stored in 1% paraformaldehyde on the fourth day were significantly lower than that in the samples stored in 4% paraformaldehyde (< 0.05 and< 0.001, respectively) as well. When 1 μl antibody was added to 50 μl anticoagulated whole blood, the median fluorescence intensity of CD4+was significantly lower than that on the date of preparation (< 0.01). From the fourth day, the median fluorescence intensities of CD4+and CD8+was significantly attenuated (< 0.01).

The antibody dilution and the concentration of paraformaldehyde determine the state of the sample and the detection results. If the samples could not be detected on the day of preparation, it should be stably stored in 4% concentration of paraformaldehyde at 4 ℃ until the fourth day after preparation. When the antibody dilution was no less than 3:50, the sensitivity of lymphocyte recognition to the cell phenotype could be ensured, and the detection should be completed within 3 days after preparation.

Flow cytometry; Antibody; Lmphocytes subsets; Cynomolgus monkeys; Paraformaldehyde

HUO Yan, Email: yanhuo@nifdc.org.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.05.003

“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項(xiàng)（2015ZX09501007-004、2018ZX09201-017）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFA0101503）

霍艷，Email：yanhuo@nifdc.org.cn

2019-07-11

*同為第一作者