抗金黃色葡萄球菌的新策略

武英，周洪彬，李文赟，吳虹麗，吳小林

(抗生素研究與再評(píng)價(jià)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川抗菌素工業(yè)研究所，成都大學(xué)， 成都 614000)

金黃色葡萄球菌能引起人類(lèi)廣泛的疾病，如膿皰病，以及危及生命的疾病，包括菌血癥和肺炎[1]。由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)引起的嚴(yán)重感染在所有已鑒定的細(xì)菌和真菌病原體中具有最高的總病死率(14%)[2]。 金黃色葡萄球菌的致病機(jī)理主要是通過(guò)分泌多種免疫系統(tǒng)逃避因子實(shí)現(xiàn)的。這些因子包括多種細(xì)胞毒素(溶血素、溶細(xì)胞肽和殺白細(xì)胞素)，免疫調(diào)節(jié)蛋白(超級(jí)抗原、超級(jí)抗原蛋白和補(bǔ)體抑制蛋白)，蛋白酶和阻止免疫細(xì)胞識(shí)別和殺滅的因子(蛋白質(zhì)A、莢膜和過(guò)氧化氫酶等)[3-7]。這些分子都以各自不同的方式，使得細(xì)菌逃避來(lái)自宿主免疫系統(tǒng)的攻擊[3,6,8]。它們不僅能夠協(xié)同抑制宿主免疫系統(tǒng)對(duì)金黃色葡萄球菌的清除，還阻止針對(duì)該病原體的免疫記憶的形成[9-11]。這也是目前金黃色葡萄球菌治療和疫苗策略失敗的主要原因。顯然，我們目前對(duì)抗金黃色葡萄球菌等病原體的應(yīng)對(duì)手段存在很大的局限性，因?yàn)樗呀?jīng)適應(yīng)了幾乎所有的免疫識(shí)別策略。其中，金黃色葡萄球菌成孔毒素對(duì)發(fā)病機(jī)制的重要貢獻(xiàn)，這些毒力因子作為潛在的治療靶點(diǎn)引起了越來(lái)越多的關(guān)注。本綜述了金黃色葡萄球菌成孔毒素的致病機(jī)理及以其為靶點(diǎn)的治療方法的最新研究進(jìn)展。

1 金黃色葡萄球菌的致病機(jī)理

產(chǎn)生能夠在細(xì)胞脂質(zhì)雙分子層內(nèi)形成孔的水溶性蛋白質(zhì)，是幾乎所有生命體中都存在的現(xiàn)象，包括人體細(xì)胞，單細(xì)胞真核生物和許多細(xì)菌。在細(xì)菌中，最常見(jiàn)的成孔分子是蛋白質(zhì)毒素分子，能夠與哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜相互作用以促進(jìn)其裂解，傳送信號(hào)分子和調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。

金黃色葡萄球菌毒力的一個(gè)關(guān)鍵組成部分是一組成孔雙組分毒素的分泌，這些毒素統(tǒng)稱(chēng)為殺白細(xì)胞素(Leucocidins)。這些殺白細(xì)胞素包括Panton-Valentine殺白細(xì)胞素(LukSF-PV或PVL)，殺白細(xì)胞素ED(LukED)，γ-溶血素(HlgAB和HlgCB)和白細(xì)胞素AB(LukAB，也稱(chēng)為L(zhǎng)ukGH)[12-13]。這些毒素由兩個(gè)獨(dú)立的水溶性單體亞單位組成，通過(guò)以受體依賴(lài)性方式靶向地與宿主白細(xì)胞膜結(jié)合并形成跨越磷脂雙層的桶狀孔(圖1)，來(lái)破壞和殺死白細(xì)胞。

雙組分殺白細(xì)胞素是由兩個(gè)亞單位，受體靶向S型亞基(在色譜柱中遷移慢：LukS-PV，LukE， HlgA， HlgC和LukA)和聚合F型亞基(在色譜柱中遷移快：LukF-PV，LukD，HlgB和LukB)[12]。在大多數(shù)宿主細(xì)胞上，S亞基識(shí)別蛋白質(zhì)受體(趨化因子受體[LukED和PVL]或整聯(lián)蛋白[LukAB / HG])以促進(jìn)與細(xì)胞表面的高親和力結(jié)合(1)，然后S亞基識(shí)別并募集F亞基(2)，導(dǎo)致宿主細(xì)胞表面的二聚化(3)。二聚化之后毒素寡聚體組裝成含有交替排列的S和F亞基的八聚體結(jié)構(gòu)（4）。寡聚化后，在S和F亞基的莖結(jié)構(gòu)域中發(fā)生主要的結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致插入膜并形成跨越宿主細(xì)胞脂質(zhì)雙層的α-桶孔(5)，引起滲透不平衡和細(xì)胞裂解[14]。

圖2(A)小鼠吞噬細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞)和人T細(xì)胞系HUT-R5(過(guò)表達(dá)CCR5的細(xì)胞系)暴露于90%致死劑量的LukED(5μg/mL)后，在光學(xué)顯微鏡(LM)和熒光顯微鏡下地圖像?？梢杂^察到特征性膜暈和細(xì)胞核的擴(kuò)張，在以溴化乙錠(EtBr)處理下細(xì)胞的滲透性增加，這是孔形成和膜損傷的指標(biāo)。白色箭頭指向殺白細(xì)胞素中毒時(shí)特征性的細(xì)胞形態(tài)變化。(B)電子顯微鏡圖像下，暴露于含有100%致死劑量的LukAB / HG(2.5μg/mL)的金黃色葡萄球菌上清液后，人多形核白細(xì)胞(hPMN)細(xì)胞系PMN HL60細(xì)胞開(kāi)始裂解[15]。

圖1 殺白細(xì)胞素跨膜空通道形成過(guò)程

圖2 殺白細(xì)胞素介導(dǎo)的免疫細(xì)胞裂解

2 殺白細(xì)胞素(Leucocidins)的種類(lèi)

目前臨床感染人類(lèi)的大多數(shù)高毒性金黃色葡萄球菌菌株產(chǎn)生五種細(xì)胞毒素：HlgAB，HlgCB，LukAB / HG，Panton-Valentine leucocidin (PVL)，LukED和 LukMF。其中LukMF存在于反芻動(dòng)物和其他非人類(lèi)哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離出的金黃色葡萄球菌譜系中。這些毒性分子的別名、基因位點(diǎn)、靶向免疫細(xì)胞、菌種分布、識(shí)別受體、毒性機(jī)理、物種特異性、亞細(xì)胞活性和溶血活性歸納整理見(jiàn)表1[14]。

3 殺白細(xì)胞素的晶體結(jié)構(gòu)

我們對(duì)這些殺白細(xì)胞素在其宿主細(xì)胞上形成孔的機(jī)制是基于對(duì)其晶體結(jié)構(gòu)的測(cè)定。1999年，測(cè)定了γ-溶血素(HlgB)和PVL(LukF-PV)的F亞基結(jié)晶測(cè)定，2004年測(cè)定了PVL的S亞基和2008年的HlgAB工程化二聚體的晶體結(jié)構(gòu)[16-17]。通過(guò)這些晶體學(xué)研究，描述了殺白細(xì)胞素的主要結(jié)構(gòu)特征(圖3)。發(fā)現(xiàn)其S和F亞基非常類(lèi)似于先前鑒定的α-溶血素的核心結(jié)構(gòu)[18]，包含功能結(jié)構(gòu)域、莖結(jié)構(gòu)域、β-夾層結(jié)構(gòu)域和氨基鎖結(jié)構(gòu)：(1)功能結(jié)構(gòu)域包括邊緣結(jié)構(gòu)域，由識(shí)別并結(jié)合磷脂和其他分子的高度芳香族殘基組成；(2)富含甘氨酸和疏水的莖結(jié)構(gòu)域，其插入宿主細(xì)胞的膜的過(guò)程中會(huì)發(fā)生顯著的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，形成β-桶狀孔結(jié)構(gòu)；(3)β-夾層結(jié)構(gòu)域，含有亞基間相互作用的關(guān)鍵殘基；(4)氨基鎖結(jié)構(gòu)，在殺白細(xì)胞素的單體到寡聚體孔結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變過(guò)程中參與莖結(jié)構(gòu)域定位，該結(jié)構(gòu)在殺白細(xì)胞素中可能是不保守的[19]。

圖3(A)γ血溶素(HlgB)的晶體結(jié)構(gòu)圖[20]，結(jié)構(gòu)信息從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB，登錄號(hào)1LKF)獲得，并且主要結(jié)構(gòu)域通過(guò)使用PyMOL軟件著色，分別：藍(lán)氨基鎖結(jié)構(gòu)區(qū)域、β-夾層結(jié)構(gòu)域、莖結(jié)構(gòu)域、邊緣結(jié)構(gòu)域。(B)HlgAB八聚體的晶體結(jié)構(gòu)[21]，結(jié)構(gòu)信息從PDB(登錄號(hào)3B07)獲得，并使用PyMOL軟件對(duì)主要結(jié)構(gòu)域進(jìn)行著色，分別：S亞基(HlgA)、F亞基(HlgB)。圖中還標(biāo)明了莖結(jié)構(gòu)、邊緣結(jié)構(gòu)、帽結(jié)構(gòu)以及β-桶狀孔結(jié)構(gòu)。

4 對(duì)抗金黃色葡萄球菌分泌殺白細(xì)胞素的新策略

最新研究發(fā)現(xiàn)，一種特異的小分子球狀蛋白Centyrins(～10kDa)，能夠靶向金黃色葡萄球菌分泌的殺白細(xì)胞素(Leukocidins)，從而消除細(xì)菌破壞宿主細(xì)胞的能力，保護(hù)人類(lèi)免疫吞噬細(xì)胞免受毒素介導(dǎo)的殺傷，這種新方法可以幫助解決抗生素耐藥性問(wèn)題。這種蛋白質(zhì)分子是研究人員從具有結(jié)合并中和殺白細(xì)胞素能力的中心蛋白質(zhì)庫(kù)中篩選而來(lái)[22]。

Centyrins，是一種支架類(lèi)蛋白質(zhì)分子[23]，衍生自人肌腱蛋白-C蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的15個(gè)纖連蛋白III型(FN3)的共有序列(圖1A)[3,23]?；谌松斓鞍?C的共有FN3結(jié)合序列的文庫(kù)(本文稱(chēng)為T(mén)ENCON)在BC環(huán)，C鏈，CD環(huán)，F(xiàn)鏈和/或FG環(huán)位置處呈現(xiàn)氨基酸多樣化性。這種蛋白分子具有高特異性和親和力，并且以非糖基化的單鏈蛋白存在，其缺乏二硫鍵，很容易在大腸埃希菌中大量生產(chǎn)。

為了鑒定能夠特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌雙組分殺白細(xì)胞素的中心蛋白，Rita Chan等進(jìn)行了一系列體外選擇，涉及親本TENCON蛋白文庫(kù)變體[3,24]，鏈和環(huán)位置的組合中具有多樣化的殘基。圖4(A)，TENCON(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)：3TES)的晶體結(jié)構(gòu)。圖中標(biāo)明了文庫(kù)的氨基酸多樣化位點(diǎn)，用于鑒定對(duì)白細(xì)胞介素具有強(qiáng)親和力的中心蛋白。(B)選擇的殺白細(xì)胞素中心蛋白和親本TENCON序列的氨基酸序列比對(duì)。環(huán)區(qū)域的位置加下劃線(xiàn)并標(biāo)記。所有序列保守的氨基酸殘基以灰色突出顯示。括號(hào)中的數(shù)字表示氨基酸在中心區(qū)中的位置。

最近研究人員使用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)文庫(kù)中親本中心進(jìn)行了更改，創(chuàng)造了一萬(wàn)億個(gè)分子結(jié)構(gòu)略微不同Centyrins。在這個(gè)巨大的文庫(kù)中，通過(guò)從蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物文庫(kù)中體外選擇肽(CIS)的方法[4]仔細(xì)篩選，發(fā)現(xiàn)了209個(gè)Centyrins分子，它們恰好能夠與金黃色葡萄球菌分泌的五種主要?dú)准?xì)胞毒素之一結(jié)合。然后通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和生物層干涉測(cè)定(BLI)確認(rèn)其結(jié)合特異性。鑒定每種球狀蛋白分子對(duì)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的多種殺白細(xì)胞素的靶向特異性(表2)[25]。

5 討論

目前正在臨床開(kāi)發(fā)許多靶向α-毒素的單克隆抗體(mAb)用于預(yù)防金黃色葡萄球菌肺炎，包括mAb MEDI4893和KBSA301[26-27]，也發(fā)現(xiàn)了許多抗LukAB單克隆抗體[28-29]。盡管目前許多有希望的分子可以治療金黃色葡萄球菌感染，但是這種單靶點(diǎn)方法的失敗有很大的先例[26]。因此，藥物開(kāi)發(fā)者在制定抗金黃色葡萄球菌療法時(shí)需要考慮整合多學(xué)科聯(lián)合策略。本文介紹的小分子球蛋白(Centyrins)通過(guò)靶向阻斷金黃色葡萄球菌的裂解白細(xì)胞活性來(lái)抑制金黃色葡萄球菌的感染性，已經(jīng)在許多臨床實(shí)驗(yàn)中[3,8,23,30]中進(jìn)行了探索。這些蛋白分子中某些表現(xiàn)出對(duì)殺白細(xì)胞素的交叉中和活性，通常，表現(xiàn)出交叉反應(yīng)特性的蛋白靶向的殺白細(xì)胞素在其亞基(例如，HlgCB和LukSF-PV)之間具有明顯的氨基酸序列保守性[14]。

圖3 殺白細(xì)胞素晶體結(jié)構(gòu)圖

金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出LukAB依賴(lài)性細(xì)胞外殺傷hPMN。雖然實(shí)驗(yàn)證明可以通過(guò)LukAB阻斷性蛋白SM1S17以濃度依賴(lài)性方式特異性中和這種細(xì)胞毒性。但是如果金黃色葡萄球菌被細(xì)胞內(nèi)化，則SM1S17的hPMN的保護(hù)作用大大降低，這些阻斷蛋白分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的途徑有限。盡管金黃色葡萄球菌傳統(tǒng)上被認(rèn)為是細(xì)胞外病原體，但越來(lái)越清楚的是金黃色葡萄球菌可以在吞噬細(xì)胞內(nèi)存活以促進(jìn)傳播和發(fā)病[31-32]。因此，該方法的一個(gè)缺陷是無(wú)法從內(nèi)部中和金黃色葡萄球菌的毒性。因此，臨床應(yīng)用Centyrins可能需要制定一種機(jī)制，使Centyrins能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞中。最近證明該策略對(duì)于將抗生素與金黃色葡萄球菌抗體結(jié)合，從而將抗生素遞送至宿主細(xì)胞內(nèi)是可行的[32]。因此將Centyrins與能夠靶向金黃色葡萄球菌表面的人源單克隆抗體融合，結(jié)合成一類(lèi)新的蛋白質(zhì)，稱(chēng)為MABtyrins，它可以更有效地中和金黃色葡萄球菌的毒性分子。這種融合蛋白的工程化為金黃色葡萄球菌感染的治療方法提供了一條潛在的途徑，并且在細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)區(qū)都具有活性[26]。

表1 金黃色葡萄球菌產(chǎn)生地殺白細(xì)胞素特點(diǎn)

圖4 選定的強(qiáng)效抗殺白細(xì)胞素蛋白的晶體結(jié)構(gòu)和序列比對(duì)

表2 從文庫(kù)中篩選出的能夠特異性結(jié)合殺白細(xì)胞素的蛋白分子centyrins種類(lèi)