脫落酸拮抗赤霉素抑制水稻地上部生長的研究

戚義東, 秦 華, 高雅迪, 王芳芳, 黃榮峰, 權(quán)瑞黨

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

ABA在幼苗生長中具有重要作用。研究表明3 μmol/L ABA可以有效地抑制水稻幼苗地上部的生長[1,2]；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在水稻幼苗期，ABA可以通過調(diào)控OsVP1、OsABF1、OsTRAB1、OsEm、OsLEA3和OsWSI18基因的表達(dá)，來影響地上部的生長[3]。此外，在脅迫條件(如水淹脅迫)下，ABA可以抑制乙烯的生成，從而影響地上部的生長[4]。ABA信號(hào)途徑是在植物脅迫應(yīng)答中起到核心作用的。在不存在ABA的情況下，2C型蛋白磷酸酶(protein phosphatase-2C，PP2C)能夠使蔗糖非酵解1型相關(guān)蛋白激酶2(sucrose non-fermenting 1-related protein kinases 2，SnRK2)去磷酸化而失去活性，從而阻斷ABA信號(hào)[5～7]。而在存在ABA的情況下，ABA與受體結(jié)合，受體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，暴露與PP2C結(jié)合的表面，從而促進(jìn)受體與PP2C的互作，抑制其磷酸酶的活性[8]，進(jìn)而使SnRK2s從PP2C-SnRK2的復(fù)合物中釋放出來，通過自磷酸化作用恢復(fù)其激酶活性，激活的SnRK2s能夠磷酸化并激活下游的ABF/AREB轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控下游的ABA應(yīng)答基因，從而激活A(yù)BA信號(hào)[9～11]。

赤霉素的主要功能是促進(jìn)水稻莖的伸長，相關(guān)機(jī)理已經(jīng)研究得較為清楚。研究表明，赤霉素促進(jìn)莖的伸長是通過促進(jìn)細(xì)胞的分裂和伸長實(shí)現(xiàn)的[12,13]，深入探究其分子機(jī)制發(fā)現(xiàn)，赤霉素可以提高木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖基酶的活性，編碼該酶的基因?yàn)镺sXTR1～OsXTR4，其中OsXTR1和OsXTR3在節(jié)間伸長中發(fā)揮著重要作用[14]；同時(shí)，微纖絲的排列方向能夠被赤霉素所改變，排列方向與細(xì)胞長軸垂直，促進(jìn)了細(xì)胞的伸長[15]。甲羥戊酸是赤霉素生物合成途徑的初前體，經(jīng)過雙萜代謝途徑，生成雙萜前體牻牛兒牻牛兒基焦磷酸(geranylgeranyl diphoaphate，GGDP)；GGDP在古巴焦磷酸合成酶(ent-copalyl diphosphate synthase，CPS)的作用下，生成古巴焦磷酸(copalyl pyrophosphate，CPP)；CPP在內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶(ent-kaurene synthase，KS)的作用下，生成內(nèi)根-貝殼杉烯；內(nèi)根-貝殼杉烯通過內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶(ent-kaurene oxidase，KO)經(jīng)過三步氧化反應(yīng)生成內(nèi)根-貝殼杉烯酸；內(nèi)根-貝殼杉烯酸在內(nèi)根-貝殼杉烯酸氧化酶(ent-kaurenoic acid oxidase，KAO)的作用下被氧化成GA12。在水稻中，由GA12最終合成赤霉素有2條途徑，一條途徑為C13-非羥基化途徑：GA12-GA15-GA24-GA9-GA4-GA3；另一條途徑為C13-羥基化途徑：GA12-GA5-GA44-GA19-GA20-GA1。參與赤霉素合成途徑的酶可以分為3大類：萜烯合成酶(terpene synthase，TPSs)、細(xì)胞色素P450單加氧酶(cytocheome P450 monooxygenases，P450s)和2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶(2-oxoglutarate-dependent dioxygen-ases，2ODDs)，其中，TPSs包括CPS和KS，P450s包括KO和KAO，2ODDs包括GA20氧化酶(GA20 oxidase，GA20ox)和GA3氧化酶(GA3 oxidase，GA3ox)[16～18]。有研究報(bào)道，赤霉素合成基因下調(diào)表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致水稻株高變矮[19]。此外，赤霉素在幼苗期表現(xiàn)為促進(jìn)水稻地上部的生長，但這方面的報(bào)道較少，分子機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。

重要糧食作物水稻的產(chǎn)量一直是研究人員密切關(guān)注的問題，ABA和赤霉素均能夠影響水稻幼苗地上部的生長，而水稻地上部的生長發(fā)育狀況會(huì)影響水稻的產(chǎn)量。但二者在調(diào)控幼苗生長中的關(guān)系尚不清楚。基于此，本研究以水稻野生型Hwayoung(HY)和IR29為研究材料，使用植物激素ABA、GA3和PAC處理，以地上部的長度和鮮重為指標(biāo)衡量三者對(duì)水稻幼苗生長發(fā)育的影響。并結(jié)合上述赤霉素生物合成途徑和已報(bào)道的基因芯片數(shù)據(jù)[20]，選擇赤霉素合成途徑的關(guān)鍵基因OsCPS1、OsKS1、OsKO2、OsKAO、OsGA20ox2和OsSHB為研究對(duì)象，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析經(jīng)ABA處理后野生型日本晴中上述基因的表達(dá)情況，從而探究ABA和赤霉素在調(diào)控幼苗地上部生長中的關(guān)系。本文通過研究ABA和GA調(diào)控水稻地上部的生長發(fā)育的分子機(jī)制，以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供提高產(chǎn)量的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑 水稻野生型日本晴、Hwayoung(HY)和IR29由實(shí)驗(yàn)室保存。Eva Green Mix購于加拿大ABM公司；RNA提取試劑盒購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司；植物激素ABA、GA3和PAC購于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 PCR儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)；PowerPac系列通用電泳儀(美國Bio-Rad公司)；7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1水稻營養(yǎng)液的配制 水稻營養(yǎng)液分為A液、B液、C液、D液和E液，均為1 000×母液，在使用時(shí)按1:1 000的比例加入到水中。A液：NH4NO380 g，NaH2PO4·2H2O 93 g，K2SO452.4 g；B液：CaCl2·2H2O 44.2 g；C液：MgCl2·6H2O 122 g；D液：FeNaEDTA 19 g；E液：H3BO33.01 g，MnSO4·5H2O 2.17 g，CuSO4·5H2O 0.075 g，ZnSO4·7H2O 0.2 g，Na2MnO4·2H2O 0.024 g。分別將上述稱取的藥品，溶解于1 L的蒸餾水中，即為所需的水稻營養(yǎng)液母液。

1.2.2水稻幼苗的培養(yǎng)和處理 水稻種子(HY和IR29)于37℃浸種24 h后，倒掉多余的水分。然后置于37℃繼續(xù)培養(yǎng)，每天早晚各換1次水，直至種子露白。挑取萌發(fā)一致的種子種到鐵架上，并將鐵架放到塑料盒中，加入6 L水稻營養(yǎng)液(A液、B液、C液、D液和E液各取6 mL，然后加水至6 L，混勻)，再加入ABA、GA3或PAC，對(duì)水稻進(jìn)行植物激素處理,對(duì)照組均加入等體積的無水乙醇?；咎幚頌?組：ABA處理組(1 μmol/L和3 μmol/L)、赤霉素處理組(0.5 μmol/L和3 μmol/L)、PAC處理組(1 μmol/L)；為了進(jìn)一步探究二者之間的關(guān)系，又設(shè)置3個(gè)處理組：3 μmol/L ABA、0.5 μmol/L GA3、3 μmol/L ABA + 0.5 μmol/L GA3。水稻種子放置在光周期為14 h光照/10 h黑暗的燈光架上，室溫培養(yǎng)，保持液面能夠接觸到種子表面，若液面下降，加水至合適高度。水稻培養(yǎng)6 d后拍照，觀察并記錄表型。同時(shí)，使用水稻營養(yǎng)液培養(yǎng)野生型日本晴幼苗，培養(yǎng)方法與上述一致。水稻培養(yǎng)6 d后，加入ABA處理(ABA的終濃度為50 μmol/L)。以加入ABA的時(shí)間作為0 h，分別取0 h、1 h、2 h和3 h的水稻葉片用于檢測(cè)赤霉素合成基因的表達(dá)。

1.2.3水稻生長發(fā)育狀況的統(tǒng)計(jì) 為了研究水稻地上部的生長發(fā)育狀況，統(tǒng)計(jì)了2個(gè)水稻生長發(fā)育指標(biāo)：地上部長度和地上部鮮重。地上部長度是從葉尖到葉基部的長度。地上部鮮重是取10株鮮活的水稻地上部，用濾紙吸掉表面多余的水分，立即稱重。本研究統(tǒng)計(jì)生長發(fā)育指標(biāo)做3次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次重復(fù)10株幼苗。

1.2.4提取水稻幼苗的RNA 使用超純RNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)提取水稻幼苗的RNA，具體的操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2.5水稻cDNA的制備 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾唯贊生物科技有限公司)制備水稻cDNA，具體的實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說明書，制備的水稻cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將制備的cDNA上機(jī)試模板，若Ct值小于20則說明模板質(zhì)量較高。本研究使用的熒光染料為SYBR Green，使用的儀器為ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。qPCR反應(yīng)體系(20 μL)為：模板1 μL，上、下游引物(引物序列見表1)各1 μL，qPCR Master Mix 10 μL，雙蒸水7 μL。qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)。以水稻中的actin肌動(dòng)蛋白基因作為qPCR反應(yīng)的內(nèi)參，每個(gè)樣品做3次平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

表1 赤霉素合成基因qPCR所用引物Table 1 qPCR primers for gibberellin synthesis genes.

1.2.7數(shù)據(jù)測(cè)量、處理和作圖 利用Image J軟件測(cè)量水稻幼苗地上部的長度；利用Excel表格對(duì)輸入的測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABA對(duì)幼苗地上部生長的影響

ABA是影響水稻生長的重要激素，外源施加ABA可以抑制水稻幼苗地上部的生長[1,2]。為了驗(yàn)證這一結(jié)論，使用1 μmol/L和3 μmol/L的ABA處理HY和IR29，對(duì)照組加入等體積的無水乙醇，在室溫條件下生長6 d后，觀察地上部的表型。結(jié)果表明ABA可以抑制水稻幼苗地上部的生長(圖1)，具體表現(xiàn)為地上部的長度變短(圖1B)和鮮重減輕(圖1C)。1 μmol/L ABA能抑制地上部的生長，但是抑制作用較弱，而3 μmol/L ABA對(duì)地上部的生長有較強(qiáng)的抑制作用。

2.2 赤霉素及其抑制劑對(duì)幼苗地上部生長的影響

赤霉素也是影響水稻生長的重要激素，其可促進(jìn)地上部的生長[19]。為了驗(yàn)證這一結(jié)論，使用0.5 μmol/L和3 μmol/L GA3處理水稻野生型HY和IR29，在室溫下培養(yǎng)6 d后，觀察地上部的表型。如圖2所示，赤霉素可以促進(jìn)水稻幼苗地上部的生長，且隨著其濃度的升高，對(duì)水稻幼苗的地上部的促進(jìn)作用越明顯，0.5 μmol/L GA3對(duì)地上部的促進(jìn)作用較弱，而3 μmol/L GA3能夠極顯著促進(jìn)地上部的生長。這種促進(jìn)作用具體表現(xiàn)在地上部長度的增長(圖2B)和地上部鮮重的增加(圖2C)。

圖1 ABA對(duì)幼苗地上部生長的影響Fig.1 Effects of ABA on seedling shoot growth.注：A：經(jīng)ABA處理后的地上部的表型；B：A圖中的地上部的長度統(tǒng)計(jì)柱形圖，統(tǒng)計(jì)結(jié)果是10株水稻幼苗地上部長度的平均值；C：A圖中的地上部的鮮重統(tǒng)計(jì)柱形圖，鮮重是10株幼苗地上部重量的平均值；數(shù)據(jù)為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到相同的結(jié)果。不同的小寫字母和大寫字母分別表示同一品種水稻幼苗的不同處理之間差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)。

圖2 赤霉素對(duì)幼苗地上部生長的影響Fig.2 Effects of gibberellic acid on seedling shoot growth.注：A：經(jīng)GA3處理后的地上部的表型；B：A圖中的地上部的長度統(tǒng)計(jì)柱形圖，統(tǒng)計(jì)結(jié)果是10株水稻幼苗地上部長度的平均值；C：A圖中的地上部的鮮重統(tǒng)計(jì)柱形圖，鮮重是10株幼苗地上部重量的平均值；數(shù)據(jù)為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到相同的結(jié)果。不同大寫字母表示同一品種水稻幼苗的不同處理之間差異極顯著(P<0.01)。

三唑類植物生長調(diào)節(jié)劑多效唑(paclobutrazol，PAC)是一個(gè)廣譜的赤霉素合成抑制劑，能夠抑制內(nèi)根-貝殼杉烯酸氧化酶的活性，其可使植物株高變矮，抑制植株的營養(yǎng)生長[21]。本研究使用1 μmol/L PAC處理HY和IR29，與對(duì)照組相比，其地上部的長度極顯著縮短(圖3B)，且地上部的鮮重極顯著減輕(圖3C)。這說明，赤霉素合成抑制劑PAC能夠抑制赤霉素的合成，從而抑制地上部的生長。

2.3 赤霉素與ABA對(duì)地上部生長的影響

2.1和2.2的研究結(jié)果表明，ABA和赤霉素均可影響水稻幼苗地上部的生長。為了進(jìn)一步探究二者之間的關(guān)系，對(duì)水稻幼苗進(jìn)行以下4種處理：對(duì)照組、3 μmol/L ABA、0.5 μmol/L GA3、3 μmol/L ABA + 0.5 μmol/L GA3。與對(duì)照組相比，3 μmol/L ABA可以顯著抑制幼苗的生長，而同時(shí)施加ABA和赤霉素發(fā)現(xiàn)ABA對(duì)水稻地上部生長的抑制作用顯著減弱(圖4)。以上結(jié)果說明，ABA和赤霉素能夠拮抗調(diào)控水稻幼苗地上部的生長，并且赤霉素能夠解除ABA對(duì)幼苗地上部生長的抑制。

2.4 ABA對(duì)赤霉素合成基因表達(dá)的影響

從2.3的研究結(jié)果可以看出，ABA和赤霉素可以拮抗調(diào)控水稻幼苗地上部的生長，而且赤霉素可以解除ABA對(duì)幼苗生長的抑制。此外，有研究表明，ABA可以影響赤霉素合成和代謝基因的表達(dá)[20]。由此推測(cè)，ABA抑制了赤霉素的合成，從而抑制了水稻幼苗地上部的生長。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，利用50 μmol/L ABA處理水稻，并分析赤霉素合成基因(OsCPS1、OsKS1、OsKO2、OsKAO、OsGA20ox2和OsSHB)的表達(dá)情況。通過qPCR分析發(fā)現(xiàn)，OsCPS1、OsKO2和OsSHB基因的表達(dá)均出現(xiàn)了先下降后上升的趨勢(shì)，且3 h處理組的結(jié)果與對(duì)照組(0 h)相比，顯著下降或上升但無顯著差異，表明ABA可以不同程度地抑制這3個(gè)基因的表達(dá)(圖5)。這說明ABA可以抑制赤霉素合成基因的表達(dá)，而赤霉素合成的關(guān)鍵基因表達(dá)量降低之后，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源的活性赤霉素含量降低，從而抑制了幼苗地上部的生長。

圖3 赤霉素合成抑制劑PAC對(duì)幼苗地上部生長的影響Fig.3 Effects of gibberellic acid biosynthesis inhibitor PAC on seedling shoot growth.注：A：經(jīng)PAC處理后的地上部的表型；B：A圖中的地上部的長度統(tǒng)計(jì)柱形圖，統(tǒng)計(jì)結(jié)果是10株水稻幼苗地上部長度的平均值；C：A圖中的地上部的鮮重統(tǒng)計(jì)柱形圖，鮮重是10株幼苗地上部重量的平均值；數(shù)據(jù)為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到相同的結(jié)果。**和***分別表示同一品種中PAC處理組與對(duì)照組相比在P<0.01和P<0.001水平上差異顯著。

圖4 赤霉素與ABA對(duì)地上部生長的影響Fig.4 Effects of gibberellic acid and ABA on seeding shoot growth.注：A：4種處理后的地上部的表型；B：A圖中的地上部長度的統(tǒng)計(jì)柱形圖，統(tǒng)計(jì)結(jié)果是10株水稻幼苗地上部長度的平均值；C：A圖中地上部鮮重的統(tǒng)計(jì)柱形圖，鮮重是10株幼苗地上部的重量；數(shù)據(jù)為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到相同的結(jié)果。不同的小寫字母和大寫字母分別表示同一品種水稻幼苗的不同處理之間差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)。

圖5 ABA對(duì)赤霉素合成基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of ABA on expression of gibberellic acid biosynthesis genes.注：A：qPCR分析生長6 d的日本晴幼苗地上部分經(jīng)50 μmol/L ABA處理后的OsCPS1、OsKS1和OsKO2的基因表達(dá)情況；B：qPCR分析生長6 d的日本晴幼苗地上部分經(jīng)50 μmol/L ABA處理后的OsKAO、OsGA20ox2和OsSHB的基因表達(dá)情況。誤差線表示3次生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。不同的小寫字母和大寫字母分別表示同一基因的不同處理時(shí)間之間差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

ABA和赤霉素都是影響水稻生長的重要植物激素，參與到許多的植物生理過程中，其中包括幼苗地上部生長[2,19]。本研究通過地上部的長度和鮮重來衡量ABA、赤霉素和PAC對(duì)幼苗(HY和IR29)生長的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ABA和赤霉素拮抗調(diào)控水稻幼苗的生長，而且赤霉素可以解除ABA對(duì)地上部生長的抑制。為了進(jìn)一步探究ABA對(duì)赤霉素合成基因表達(dá)的影響，利用ABA處理野生型日本晴，并通過qPCR檢測(cè)了赤霉素合成基因的誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ABA可以抑制赤霉素合成基因的表達(dá)。綜上所述，ABA能夠抑制赤霉素合成基因的表達(dá)，導(dǎo)致植物體內(nèi)的活性赤霉素含量降低，從而抑制幼苗地上部的生長。

已有的研究報(bào)道主要集中在ABA和赤霉素拮抗調(diào)控種子的萌發(fā)和休眠[22]，但是ABA和赤霉素協(xié)同調(diào)控幼苗地上部生長的關(guān)系尚不清楚。為了確定調(diào)控模式，本研究利用ABA處理的同時(shí)外源施加低濃度的GA3，發(fā)現(xiàn)解除了ABA對(duì)生長的抑制作用?；谏鲜霰硇屯茰y(cè)，ABA導(dǎo)致了內(nèi)源的活性赤霉素含量降低，所以抑制了水稻幼苗地上部的生長，而低濃度的GA3彌補(bǔ)了植物體內(nèi)缺少的活性赤霉素，使其恢復(fù)到野生型地上部的長度和鮮重。為了驗(yàn)證此假設(shè)，利用ABA處理已培養(yǎng)6 d的幼苗，qPCR檢測(cè)幼苗地上部赤霉素合成基因的表達(dá)，研究結(jié)果表明ABA可以抑制赤霉素合成基因的表達(dá)。

本研究揭示了ABA位于赤霉素生物合成途徑的上游，負(fù)調(diào)控赤霉素生物合成基因的表達(dá)，而后續(xù)需要進(jìn)一步探究的是：赤霉素合成途徑的上游基因。目前的假設(shè)是上游基因可能是ABA信號(hào)途徑下游的轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子可以負(fù)調(diào)控多個(gè)關(guān)鍵赤霉素生物合成基因的表達(dá)，且直接結(jié)合在其中某個(gè)基因的啟動(dòng)子上，直接調(diào)控該基因的表達(dá)。本研究闡述了在水稻幼苗生長中ABA和赤霉素之間的相互作用機(jī)制，為利用ABA信號(hào)途徑改良水稻的生長提供了理論依據(jù)。