樹莓1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶基因(RiACS)家族成員的克隆及生物信息學(xué)分析

周義杰，閆希煥，高亭豪，劉 芳，楊明峰，馬蘭青，3*

(1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.生物與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；3.北京農(nóng)學(xué)院北京林果業(yè)生態(tài)環(huán)境功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 102206)

樹莓(Raspberry)是薔薇科(Rusaceae)懸鉤子屬(RubusL.)小漿果類灌木的統(tǒng)稱，又名托盤、山莓、懸鉤子等，是世界公認(rèn)的第三代新興水果，有“黃金水果”“生命之果”之稱。樹莓在栽培上主要有空心莓亞屬(SubgenusIdeobatus)和實(shí)心莓亞屬(SubgenusEubatus)兩個(gè)亞屬，其主要區(qū)別是空心莓亞屬果實(shí)成熟時(shí)與花托分離而實(shí)心莓亞屬果實(shí)成熟時(shí)與花托同落?？招妮畞唽儆袣W洲紅樹莓(Rubusidaeus)、黑樹莓(Rubusoccidentalis)和紫樹莓(Rubusneglectus)3個(gè)種群，實(shí)心莓亞屬有黑莓、無(wú)刺黑莓、匍匐形黑莓和黑莓雜交種4個(gè)種群[1]。樹莓果實(shí)柔嫩多汁，色澤鮮艷，香氣濃郁，風(fēng)味獨(dú)特，富含多種對(duì)人體有益的活性成分，如超氧化物歧化酶、鞣花酸、黃酮、類黃酮、樹莓酮等，具有抗氧化、抗癌、抗菌消炎、抑制肥胖、預(yù)防心血管疾病等作用[2-5]。樹莓除了果實(shí)能夠鮮食外，還廣泛用于食品、制藥、保健品、化妝品生產(chǎn)等行業(yè)，發(fā)展前景廣闊[6]。近年來(lái)，中國(guó)樹莓產(chǎn)業(yè)推廣速度較快，種植的面積和產(chǎn)量逐漸增加，但樹莓果實(shí)采收時(shí)節(jié)氣溫較高，果實(shí)極不耐貯存，容易在運(yùn)輸過(guò)程腐爛變質(zhì)，導(dǎo)致樹莓鮮果上市期短，常溫下貨架期只有1～2 d[7]，限制樹莓產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

乙烯是一種重要的內(nèi)源性植物激素，存在于植物的各個(gè)器官和組織中，參與調(diào)控高等植物的許多生理過(guò)程，比如種子萌發(fā)，生根，葉片、花器官的衰老、果實(shí)成熟和逆境脅迫等[8]。乙烯在植物中合成途徑為：腺苷蛋氨酸合成酶催化蛋氨酸與腺苷酸(adenosine monophosphate, AMP)反應(yīng)生成腺苷蛋氨酸(s-adenosvlmeIhionine, SAM)；ACS催化SAM生成1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylate, ACC)；ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase, ACO)催化ACC氧化生成乙烯，其中ACS是整個(gè)合成途徑的限速酶[9]。自1990年從番茄果實(shí)的cDNA文庫(kù)中分離得到第一個(gè)ACS基因序列以來(lái)[10]，研究人員已經(jīng)在很多植物中分離出ACS基因，所有這些植物中都含有一個(gè)以上的ACS基因[11-15]，說(shuō)明ACS是由多基因家族編碼的。

電子克隆(insilicocloning)是隨著基因組計(jì)劃和EST(Expressed Sequence Tag)計(jì)劃發(fā)展起來(lái)的基因克隆新技術(shù)。與傳統(tǒng)的圖位克隆、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)、遞減雜交技術(shù)等方法相比具有成本低、速度快、操作簡(jiǎn)單、目的性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)[16-18]。利用電子克隆技術(shù)進(jìn)行樹莓ACS基因家族成員的克隆，從中尋找與果實(shí)成熟相關(guān)的ACS基因，可以推進(jìn)樹莓果實(shí)成熟衰老機(jī)制的研究和應(yīng)用，改善樹莓果實(shí)不耐貯藏的特性，對(duì)于樹莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。然而傳統(tǒng)的電子克隆技術(shù)依賴大量EST序列進(jìn)行推測(cè)、組裝和拼接來(lái)獲得基因的電子序列[19]，所以對(duì)于EST資料不夠豐富的物種無(wú)能為力。與一些模式植物和其他薔薇科經(jīng)濟(jì)植物相比，樹莓的EST資料遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到傳統(tǒng)電子克隆技術(shù)的要求。本研究使用一種新的電子克隆方案，通過(guò)ACS家族蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域與樹莓基因組比對(duì)獲得基因的電子序列，然后進(jìn)行基因組PCR驗(yàn)證，最終獲得6條ACS基因，并對(duì)基因序列和其編碼蛋白的理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)、同源性等進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，為后續(xù)研究樹莓ACS基因家族成員的差異表達(dá)和樹莓果實(shí)成熟機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

樹莓植物材料為本實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng)保存，品種為‘托拉蜜’(Tulameen)。主要試劑有：植物DNA提取試劑盒(Magen，Guangzhou，China)，金牌Mix高保真PCR酶(Tsingke，Beijing，China)，膠回收試劑盒(Magen，Guangzhou，China)，pClone007克隆載體(Tsingke，Beijing，China)，DH5-α感受態(tài)細(xì)胞(Tsingke，Beijing，China)，質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?Magen，Guangzhou，China)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樹莓ACS基因家族成員的電子克隆 以NCBI登錄的薔薇科ACS蛋白序列XP_004306735、XP_024176223、XP_021807957和XP_007219056與已知的擬南芥ACS蛋白家族序列[20]進(jìn)行比對(duì)，得到薔薇科ACS蛋白的7個(gè)保守結(jié)構(gòu)域序列，將之分別與GDR(Genome Database for Rosaceae)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rosaceae.org/)中樹莓基因組進(jìn)行tblastn比對(duì)，得到樹莓ACS基因家族成員的電子序列及其所在染色體的位置信息。

1.2.2 樹莓ACS基因家族成員的分子克隆及序列分析 根據(jù)所得電子序列使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，由北京瑞博興科生物技術(shù)公司合成。取樹莓組培苗葉片200 mg使用植物DNA提取試劑盒提取基因組DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系為：金牌mix 45 μL，上游引物(10 μmol/L)2 μL，下游引物(10 μmol/L) 2 μL，模板(100 ng/μL) 1 μL。PCR條件為：98 ℃，2 min；98 ℃ 10 s，Tm (RiACS1-6分別為：54、55、57、52、57、56 ℃) 15 s，72 ℃，45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后連接到pClone007克隆載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單克隆搖菌并進(jìn)行菌液PCR，使用PCR呈陽(yáng)性的菌液提取質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序所得基因序列使用SnapGene軟件分析GC含量，使用Augustus程序(http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus/)分析開(kāi)放閱讀框(ORF，Open Reading Frame)和內(nèi)含子，并獲得CDS(Coding Sequences)序列和其所編碼的蛋白序列[21]，使用DNAMAN軟件比較基因序列和蛋白序列之間的相似性。

表1 樹莓ACS基因家族成員克隆引物Tab.1 Cloning primers of raspberry ACS family genes

1.2.3 樹莓ACS家族蛋白序列的生物信息學(xué)分析 使用ExpPASYProtParam程序(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的理化性質(zhì)[22]，使用SignalP 4.1 Server程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)[23]，使用TMHMMServer 2.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[24]，使用PSORT程序(http://psort1.hgc.jp/form.html)進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，使用SOPMA程序(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[25]，使用SWISS-MODEL軟件(https://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行蛋白三維結(jié)構(gòu)同源建模[26]，使用DNAMAN軟件進(jìn)行蛋白多序列比對(duì)，使用MEGA 7.0軟件生成系統(tǒng)進(jìn)化樹[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹莓ACS家族成員的序列獲得及分析

由薔薇科ACS蛋白與擬南芥ACS蛋白序列比對(duì)，得到7個(gè)薔薇科蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列如下：IQMGLAEN、FQDY、FCLADPGDAFL、NPSNPLGT、YSLSKDMG、KMSSFGLVSSQTQ、PGWFRVCFA，將其分別與樹莓基因組進(jìn)行比對(duì)后得到6條樹莓ACS基因家族成員的電子序列，將其按照染色體順序命名。根據(jù)電子序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行基因組PCR(圖1)，將PCR膠回收產(chǎn)物連接克隆載體測(cè)序，得到樹莓ACS家族成員的基因序列。所得基因序列已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，序列號(hào)為 MK388675、

注：M. Marker；1. RiACS5；2. RiACS4；3. RiACS1；4. RiACS6；5. RiACS2；6. RiACS3。Note: M. Marker；1. RiACS5；2. RiACS4；3. RiACS1；4. RiACS6；5. RiACS2；6. RiACS3.圖1 樹莓ACS基因家族成員PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of raspberry ACS family genes

MK388676、MK388677、MK388678、MK388679、MK388680。對(duì)其進(jìn)行序列分析(表2)發(fā)現(xiàn)，RiACS1-6的GC含量均小于50%，與全基因組GC含量吻合[28]，ORF長(zhǎng)度在1 657～2 432 bp之間，除了RiACS1和RiACS2外其余均包含部分5′非翻譯區(qū)和3′非翻譯區(qū)序列，RiACS1含有2個(gè)內(nèi)含子而其余均含有3個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子的長(zhǎng)度不等，最短的僅85 bp而最長(zhǎng)的達(dá)713 bp，去除內(nèi)含子后得到的CDS序列長(zhǎng)度在1 392～1 608 bp之間。

表2 樹莓ACS基因家族成員序列分析Tab.2 Sequence analysis of raspberry ACS family genes

使用DNAMAN軟件對(duì)所得的基因序列和翻譯而成的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示樹莓ACS家族成員之間基因序列相似性為39%～70%，蛋白序列相似性為29%～68%，這一結(jié)果與擬南芥中的研究結(jié)果一致[20]，說(shuō)明ACS家族成員的序列之間具有較大的差異性。

2.2 樹莓ACS家族蛋白理化性質(zhì)分析

ExpPASYProtParam的蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，RiACS1-6的理論等電點(diǎn)集中在6.05～8.95；RiACS3和RiACS6正電荷殘基數(shù)小于負(fù)電荷殘基數(shù)，整體帶負(fù)電，其余整體帶正電；RiACS1-6不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，可能不穩(wěn)定，總平均疏水性均小于0，可能是親水性蛋白[22]。

2.3 樹莓ACS家族蛋白信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

SignalP的信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示樹莓ACS家族蛋白均不含有信號(hào)肽，為非分泌蛋白。TMHMMServer的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示RiACS4在第33—57個(gè)氨基酸位置具有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)其為跨膜蛋白，其余蛋白都不含跨膜結(jié)構(gòu)域，為非跨膜蛋白，但RiACS6有部分氨基酸在膜內(nèi)。PSORT的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明RiACS1定位于細(xì)胞核的概率最大，為76.0%，RiACS2定位于細(xì)胞核的概率最大，為88.0%，RiACS3定位于細(xì)胞核的概率最大，為60.0%，RiACS4定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的概率最大，為60.0%，RiACS5定位于細(xì)胞質(zhì)的概率最大，為65.0%，RiACS6定位于高爾基體的概率最大，為90.0%。

2.4 樹莓ACS家族蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

SOPMA的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果(表3)表明樹莓ACS家族蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，分別占到36.26%～43.25%和33.76%～39.63%，各蛋白成員之間二級(jí)結(jié)構(gòu)組成區(qū)別不是很大。

表3 樹莓ACS家族蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Tab.3 Secondary structure prediction of raspberry ACS family proteins

2.5 樹莓ACS家族蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

將樹莓ACS家族蛋白輸入SWISS-MODEL在線建模程序，以自動(dòng)匹配模板方式進(jìn)行同源建模，結(jié)果顯示自動(dòng)匹配到的模板均為ACS蛋白，GMQE值均在0.6～1.0之間，QMEAN值均大于0，覆蓋度均較高，說(shuō)明建模結(jié)果較為可靠。ACS蛋白以同源二聚體或異源二聚體的形式行使蛋白功能[29]，建模結(jié)果預(yù)測(cè)RiACS1-6蛋白均以同源二聚體的形式存在，符合預(yù)期。由三維結(jié)構(gòu)圖(圖2)可以看出，RiACS1-6蛋白均以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致；RiACS1、RiACS2、RiACS4、RiACS6三級(jí)結(jié)構(gòu)相近，而RiACS3和RiACS5三級(jí)結(jié)構(gòu)相近。

注：A-F RiACS1-6三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。Note: A-F three-dimensional structure prediction of RiACS1-6.圖2 樹莓ACS家族蛋白的三維構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Three-dimession prediction of raspberry ACS family proteins

2.6 樹莓ACS家族蛋白同源性分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

使用NCBI的blastp工具對(duì)樹莓ACS家族蛋白進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)其與其他薔薇科植物的ACS蛋白序列均具有較高的相似性，其中與月季ACS蛋白序列相似性最高，RiACS1與月季ACS3序列相似性為91%，RiACS2與月季ACS1序列相似性為92%，RiACS5與月季ACS2序列相似性為89%。使用DNAMAN軟件對(duì)樹莓ACS家族蛋白和月季ACS家族蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，RiACS1-6均含有ACS蛋白典型的7個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，而RiACS4和RiACS6在第6個(gè)結(jié)構(gòu)域處與其他蛋白成員差異較大，這一結(jié)果與擬南芥中ACS10和ACS12的特點(diǎn)類似[20](圖3)。

將樹莓ACS家族蛋白序列和擬南芥ACS家族蛋白序列導(dǎo)入MEGA軟件，進(jìn)行Clustalw 比對(duì)后使用鄰接法(NJ)生成系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap值設(shè)為1000(圖4)。擬南芥ACS家族蛋白根據(jù)C末端序列差異可以分為三個(gè)類型：Type I是ACS1、ACS2和ACS6；Type II是ACS4、ACS5、ACS8和ACS9；Type III是ACS7、ACS11，此外AtACS10和AtACS12執(zhí)行氨基轉(zhuǎn)移酶功能[12,20,30-31]。從進(jìn)化樹可以看出，樹莓ACS家族蛋白可分為3組，RiACS3、RiACS5與AtACS1、AtACS2、AtACS6聚集于同一分支，可能是Type Ⅰ型ACS蛋白；RiACS1、RiACS2與AtACS4、AtACS5、AtACS8、AtACS9聚集于同一分支，可能是Type Ⅱ型ACS蛋白；RiACS4、RiACS6與AtACS10、AtACS12聚集于同一分支，可能執(zhí)行氨基轉(zhuǎn)移酶功能。

圖3 樹莓ACS家族蛋白與月季ACS蛋白多序列比對(duì)Fig.3 Multiple sequence alignment of raspberry ACS family proteins with rose ACS protein

圖4 樹莓ACS家族蛋白進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of raspberry ACS family proteins

3 討 論

樹莓是一種廣受歡迎的新興水果，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，然而樹莓果實(shí)極不耐貯存的特點(diǎn)阻礙了樹莓產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。乙烯在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要調(diào)控作用，根據(jù)成熟衰老過(guò)程乙烯釋放和呼吸強(qiáng)度變化的不同，果實(shí)可分為躍變型和非躍變型兩類，樹莓果實(shí)屬于非躍變型。20世紀(jì)乙烯被認(rèn)為在非躍變型果實(shí)成熟衰老中發(fā)揮的作用非常有限，然而近年來(lái)越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，非躍變型果實(shí)的成熟衰老過(guò)程也受乙烯調(diào)控[32-34]。目前有研究表明乙烯參與樹莓果實(shí)成熟進(jìn)程[35]，然而其分子機(jī)理仍不清楚。乙烯合成的關(guān)鍵酶是ACS，因此，進(jìn)行樹莓ACS基因的克隆和分析有助于推進(jìn)樹莓果實(shí)成熟機(jī)制的研究，為改善樹莓果實(shí)不耐貯存的特性提供理論基礎(chǔ)。

隨著基因組計(jì)劃的進(jìn)行，越來(lái)越多的物種完成了全基因組測(cè)序。與此同時(shí)，其中很多物種的EST資料卻沒(méi)有大規(guī)模的增長(zhǎng)。傳統(tǒng)的電子克隆利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)獲取電子序列，在EST資料不夠豐富的物種中無(wú)法應(yīng)用。本試驗(yàn)使用蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的方法進(jìn)行電子克隆，避開(kāi)EST數(shù)據(jù)庫(kù)的限制。試驗(yàn)結(jié)果獲得6個(gè)樹莓ACS家族成員的基因序列和其蛋白序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。值得一提的是，在電子克隆過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)推測(cè)的第7條ACS基因(數(shù)據(jù)未顯示)，其特點(diǎn)是基因分為前后兩段，兩段分別比對(duì)都具有ACS基因特征。在基因兩端設(shè)計(jì)特異性引物以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條長(zhǎng)度遠(yuǎn)小于原本電子序列的基因片段，使用Augustus程序進(jìn)行內(nèi)含子分析發(fā)現(xiàn)其不含內(nèi)含子，翻譯后的蛋白序列經(jīng)同源性分析屬于ACS蛋白片段。由此可以推測(cè)樹莓中存在第7條ACS基因，其電子序列由前后兩段ACS基因構(gòu)成的特點(diǎn)有可能是測(cè)序錯(cuò)誤導(dǎo)致的。一般意義上的基因全長(zhǎng)是指包含5′非翻譯區(qū)、ORF和3′非翻譯區(qū)的cDNA序列，現(xiàn)在的生物信息學(xué)手段無(wú)法通過(guò)基因組序列準(zhǔn)確預(yù)測(cè)mRNA的5′非翻譯區(qū)和3′非翻譯區(qū)序列，所以雖然從基因組克隆到RiACS3、RiACS4、RiACS5、RiACS6的ORF區(qū)兩端非翻譯區(qū)序列，但仍無(wú)法確定其是否為基因全長(zhǎng)，后續(xù)試驗(yàn)可以借助RT-PCR技術(shù)和RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技術(shù)來(lái)獲取包括第7條ACS基因在內(nèi)的樹莓ACS多基因家族成員的cDNA全長(zhǎng)序列。

對(duì)本試驗(yàn)獲得的樹莓ACS家族基因序列和蛋白序列進(jìn)行相似性比較，發(fā)現(xiàn)其成員之間具有較大的序列差異性。此外，盡管屬于同家族基因，但其成員之間內(nèi)含子數(shù)目和長(zhǎng)度都不盡相同，其中RiACS1包含2個(gè)較短的內(nèi)含子，RiACS3和RiACS5則含有兩短一長(zhǎng)的3個(gè)內(nèi)含子，而RiACS4和RiACS6含有短-長(zhǎng)-短3個(gè)內(nèi)含子，這一發(fā)現(xiàn)也從側(cè)面證明ACS多基因家族成員之間的序列差異性。樹莓ACS家族蛋白的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析表明其均為不穩(wěn)定的親水性蛋白，均不含信號(hào)肽。RiACS1、RiACS2和RiACS3可能是位于細(xì)胞核的非跨膜蛋白，RiACS4可能是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的跨膜蛋白，RiACS5可能是位于細(xì)胞質(zhì)的非跨膜蛋白，RiACS6可能是位于高爾基體的非跨膜蛋白。一般定位于內(nèi)膜系統(tǒng)的蛋白和跨膜蛋白均含有信號(hào)肽，但RiACS4和RiACS6的預(yù)測(cè)結(jié)果卻不含信號(hào)肽，可能是由于信號(hào)肽或亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)軟件結(jié)果不準(zhǔn)確導(dǎo)致的。RiACS1-6的二級(jí)結(jié)構(gòu)較為相似，均以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，三級(jí)結(jié)構(gòu)均以同源二聚體形式存在，分為RiACS3、RiACS5和RiACS1、RiACS2、RiACS4、RiACS6兩組。它們均含有7個(gè)ACS蛋白保守結(jié)構(gòu)域，但RiACS4和RiACS6在第6個(gè)結(jié)構(gòu)域處與其他蛋白有所差異，并且在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，RiACS4和RiACS6與擬南芥ACS10、ACS12聚集于同一分支，而擬南芥ACS10、ACS12是氨基轉(zhuǎn)移酶，所以推測(cè)RiACS4和RiACS6有可能是氨基轉(zhuǎn)移酶的一種而不是ACS。

研究表明，植物ACS基因的表達(dá)具有組織、器官特異性，時(shí)空特異性，且受外界環(huán)境的影響[36]。本試驗(yàn)克隆到樹莓6條ACS基因家族成員，后續(xù)可以開(kāi)展RT-qPCR等試驗(yàn)來(lái)研究不同ACS基因家族成員在樹莓中的表達(dá)差異性，找到在樹莓果實(shí)成熟過(guò)程中特異性表達(dá)的ACS基因，為進(jìn)一步研究樹莓果實(shí)成熟機(jī)制奠定基礎(chǔ)。