板栗非胚性愈傷組織DsRed基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法建立和優(yōu)化

李 志，邢 宇,b，房克鳳，曹慶芹，秦 嶺,b，張 卿,b*

(北京農(nóng)學(xué)院 a.植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，b.北京林果業(yè)生態(tài)功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心,c.園林學(xué)院，d.生物與資源環(huán)境學(xué)院，北京 102206)

板栗為殼斗科(Fagaceae)栗屬(Castanea)植物，是兼具生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的特色經(jīng)濟(jì)林樹種，其堅(jiān)果中淀粉含量占干物質(zhì)的46%～64%[1]，被稱為“鐵桿莊稼”，自古就是重要的木本糧食。中國板栗資源豐富，在全國26個(gè)省、市、自治區(qū)均有栽培。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO)統(tǒng)計(jì)，2016年中國板栗栽培面積為32.6萬hm2，總產(chǎn)量187.9萬t，分別占世界的54.1%和83.2%，均居世界第一。近年來，中國山區(qū)板栗平均不足1.5 t/hm2，產(chǎn)量低已經(jīng)成為限制板栗產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。眾所周知，板栗產(chǎn)量形成和品質(zhì)調(diào)控的過程是淀粉積累的過程，因此，板栗淀粉積累的分子機(jī)理研究一直是關(guān)注的重點(diǎn)。然而，有關(guān)板栗淀粉積累分子機(jī)理研究的報(bào)道相對較少。鑒定并克隆出板栗淀粉分支酶基因CmSBE的全長，并發(fā)現(xiàn)CmSBE主要參與調(diào)控板栗支鏈淀粉的生物合成[2-3]；王猛等克隆出板栗堅(jiān)果顆粒淀粉結(jié)合酶基因GBSS全長并進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析[4]。板栗淀粉積累的分子機(jī)理研究相對較少的主要原因之一可能是板栗相關(guān)基因的功能驗(yàn)證體系仍不完善。目前，僅在美洲栗和歐洲栗中初步建立胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化體系[5-6]，而且該技術(shù)體系存在一定缺陷：胚性愈傷組織誘導(dǎo)困難、數(shù)量少、周期長，限制栗屬植物重要基因功能的驗(yàn)證。板栗體細(xì)胞胚可誘導(dǎo)大量的非胚性愈傷組織，利用非胚性愈傷組織在細(xì)胞水平上開展淀粉代謝及調(diào)控的分子機(jī)理研究?；诖?，本試驗(yàn)通過轉(zhuǎn)化紅色標(biāo)志基因DsRed建立板栗非胚性愈傷組織瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)體系并進(jìn)行優(yōu)化研究，為今后開展板栗淀粉和糖代謝相關(guān)基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株和載體

板栗非胚性愈傷組織由采自北京市懷柔區(qū)板栗實(shí)驗(yàn)站的‘燕山紅栗’(Castaneamollissima‘Yanshanhongli’)幼胚根尖誘導(dǎo)。菌株為GV3101，購自上海唯地公司。載體為Gateway系統(tǒng)的植物RNAi沉默載體277，為北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒攜帶標(biāo)記基因DsRed，其表達(dá)產(chǎn)物為紅色熒光蛋白。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 板栗非胚性愈傷組織誘導(dǎo) 參考Lu等的誘導(dǎo)方法并稍做改進(jìn)[7]。采集板栗花后60 d的堅(jiān)果，消毒后用無菌蒸餾水沖洗，分離出幼胚根尖，將其置于E1培養(yǎng)基(Embryo initiation medium，E1)中，在黑暗中連續(xù)培養(yǎng)56 d以上，直至板栗非胚性愈傷組織形成。

1.2.2 板栗非胚性愈傷組織侵染方法及優(yōu)化 參考美洲栗轉(zhuǎn)化方法[8]。將帶有DsRed基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌，在液體Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)中培養(yǎng)，離心，棄上清，將沉淀溶于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，侵染板栗非胚性愈傷組織，并進(jìn)行超聲波處理，然后在垂直混合儀中共培養(yǎng)。取出非胚性愈傷組織，盡量除去菌液，轉(zhuǎn)移到含有無菌濾紙的培養(yǎng)皿，繼續(xù)暗培養(yǎng)。將板栗非胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到帶有特美汀和頭孢噻污抗生素的固體培養(yǎng)基上，平鋪成近似橢圓形，再次進(jìn)行暗培養(yǎng)。共培養(yǎng)7 d后，在體式熒光顯微鏡(蔡司公司，Discovery.V20)下進(jìn)行觀察。

文獻(xiàn)顯示，影響遺傳轉(zhuǎn)化率的重要因子主要有菌液濃度[9]、超聲處理時(shí)間[10]、共培養(yǎng)時(shí)間[11]、干燥時(shí)間[12]等，因此，針對這四個(gè)因子設(shè)計(jì)四因素五水平正交試驗(yàn)，探索侵染效率最高的最優(yōu)組合。

本試驗(yàn)通過設(shè)計(jì)L25(54)正交試驗(yàn)對轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵因素，即菌液濃度(A)、超聲處理時(shí)間(B)、共培養(yǎng)時(shí)間(C)、干燥時(shí)間(D)進(jìn)行優(yōu)化，每次試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)，見表1。

表1 板栗愈傷組織瞬時(shí)轉(zhuǎn)化正交試驗(yàn)因素水平Tab.1 Transient transformation orthogonal test factors levels in chestnut callus

1.2.3 侵染效率分析方法 利用體視熒光顯微鏡對每個(gè)試驗(yàn)處理隨機(jī)選取3個(gè)板栗非胚性愈傷組織細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行拍照，利用imageJ軟件分析熒光強(qiáng)度并計(jì)算平均值，用熒光強(qiáng)度代表侵染效率進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗非胚性愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)

經(jīng)過56 d的誘導(dǎo)，外植體成功誘導(dǎo)為板栗非胚性愈傷組織，并進(jìn)行繼代培養(yǎng)。板栗非胚性愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中為白色，外表緊湊，形狀不規(guī)則，見圖1。

圖1 板栗非胚性愈傷組織Fig.1 Chestnut non-embryonic callus

2.2 非胚性愈傷組織瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法建立

板栗非胚性愈傷組織共培養(yǎng)7 d后，即可在體視熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光，表明成功將帶有DsRed基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入板栗非胚性愈傷組織細(xì)胞并正常表達(dá)，見圖2。

圖2 板栗非胚性愈傷組織DsRed基因表達(dá)Fig.2 Expression of DsRed gene in chestnut non-embryonic callus注：A1為熒光體視顯微鏡眀場下的非胚性愈傷組織；A2為在熒光體視顯微鏡綠光下與A1相同的非胚性愈傷組織；B1為熒光體視顯微鏡眀場下未經(jīng)任何處理的板栗非胚性愈傷組織；B2為熒光體視顯微鏡綠光下未經(jīng)任何處理的與B1相同的板栗非胚性愈傷組織。Note: A1.Transformed non-embryonic callus observed under white light; A2. The same non-embryonic callus showed in A1 observed under green light showing red fluorescence; B1. Non-embryonic callus without any treatment observed under white light; B2. The same non-embryonic callus showed in B1 observed under green light showing red fluorescence.

2.3 非胚性愈傷組織瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法優(yōu)化

板栗非胚性愈傷組織在不同試驗(yàn)組合處理下，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化DsRed基因發(fā)出的紅色熒光強(qiáng)度見表2。k1-k5是1-5水平試驗(yàn)熒光強(qiáng)度的平均值，其中最大值代表的水平即為該因素的最優(yōu)水平；R是k1-k5的極差，R值越大，表明該因素對于試驗(yàn)結(jié)果的影響程度越大。

表2 板栗愈傷組織瞬時(shí)轉(zhuǎn)化正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Transient transformation orthogonal test results of chestnut callus

由表2可知，在菌液濃度(A)各個(gè)水平中，k3水平最大，達(dá)到了35.205，表明菌液OD600為1.5時(shí)侵染效率最高；超聲時(shí)間(B)為k4水平時(shí)，共培養(yǎng)時(shí)間(C)為k1水平時(shí)和干燥時(shí)間(D)為k4水平時(shí)，板栗非胚性愈傷組織的侵染轉(zhuǎn)化效率最高。板栗非胚性愈傷組織瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系的最優(yōu)條件為A3B4C1D4，即菌液為OD600=1.5，超聲時(shí)間為90 s，共培養(yǎng)時(shí)間為1 h，干燥時(shí)間為3 d。同時(shí)，從表2可知，菌液濃度R值為19.489，共培養(yǎng)時(shí)間R值為13.562，干燥時(shí)間和超聲時(shí)間R值小于10，說明菌液濃度對非胚性愈傷組織瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率的影響最大。

3 討 論

在美洲栗和歐洲栗中，Corredoira等和Newhouse等分別利用胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化體系將編碼幾丁質(zhì)酶的內(nèi)源性CsCh3基因和OxO基因轉(zhuǎn)化到歐洲栗和美洲栗中，并獲得穩(wěn)定的遺傳表型[6,8]。在體細(xì)胞胚再生體系中，Lu等人發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率較低，板栗胚珠的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率僅為28.22%[7]；胚性愈傷組織的不同發(fā)育階段需要更換不同種類的培養(yǎng)基(E1-E4)，操作比較復(fù)雜；該轉(zhuǎn)化體系試驗(yàn)周期長，即使是相對成熟的美洲栗胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化體系，至少需要培養(yǎng)42 d才能觀察到表型。這些問題限制栗屬植物基因功能的研究。本試驗(yàn)建立的板栗非胚性愈傷瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系能夠滿足細(xì)胞水平上開展淀粉和糖類代謝及其分子調(diào)控機(jī)理研究的需求。非胚性愈傷組織誘導(dǎo)率較高(49.81%)，操作簡單，而且共培養(yǎng)7 d后在細(xì)胞水平進(jìn)行表型驗(yàn)證。該體系是一種簡單、快速、高效的基因驗(yàn)證體系，為在細(xì)胞水平上開展物質(zhì)代謝及其分子調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。