一個大豆矮稈性狀基因的分子標(biāo)記定位

袁 鷹，王 程，韓 俊，張 鑫，仝 瀟，馮凡育，謝 皓

(北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

株高對作物生長的群體結(jié)構(gòu)和產(chǎn)量來說是很重要的農(nóng)藝性狀[1]。近年來，隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的飛速發(fā)展，對作物高產(chǎn)性狀、高產(chǎn)機(jī)理及其相關(guān)基因的研究愈加深入，培育理想株型已成為作物育種的重要目標(biāo)[2]。合理株型是高產(chǎn)品種的生育基礎(chǔ)和形態(tài)特征，其中矮稈是理想株型的一個重要性狀[3]，矮稈基因的利用對于20世紀(jì)“綠色革命”起到?jīng)Q定性作用[4]。例如，將大豆中抗倒伏的有限結(jié)莢習(xí)性基因dt1轉(zhuǎn)育到無限結(jié)莢習(xí)性的北方高產(chǎn)品種中，育成Elf、Sprite、Hobbit、Gnome等半矮稈品種，在高產(chǎn)環(huán)境下采取高密度種植實(shí)現(xiàn)超高產(chǎn)，并得到大面積推廣應(yīng)用[5]。

前人曾用傳統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)分析方法研究大豆株高的遺傳規(guī)律，認(rèn)為株高是多基因控制的數(shù)量性狀，遺傳力較高，受1～2對主效基因和微效多基因控制[6-7]，陳恒鶴等[8]研究指出“矮源矬”的株高性狀受1對隱性主效基因和多個修飾基因共同控制，而Kilen等研究表明大豆品種PI227224的矮稈性狀是由單個隱性基因控制[9-10]。Hwang等[11]在輻照大豆種子的快速鑒定中得到1個矮稈突變體，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析表明，存在1個803 bp的缺失區(qū)域可能與矮稈表現(xiàn)型相關(guān)。Cheng等[12]用γ射線誘變M2群體大豆得到2個都是隱性遺傳方式的突變體Gmdwf1和Gmdwf2。Li等[13]用EMS誘變大豆栽培品種中品661，得到1對隱性核基因控制能明顯降低株高和縮短莖節(jié)尖的DW突變體。

本課題組在育種工作中，利用海系13為母本與父本北農(nóng)103雜交，在(海系13×北農(nóng)103)F4部分剩余雜合體分離群體(RHL)中發(fā)現(xiàn)高稈/矮稈性狀分離明顯。北農(nóng)103為北京市審定的夏播品種，從中黃18種子60Co-γ輻照的衍生后代選育而成，而中黃18的雜交組合為中品661×Century-2。Century-2是優(yōu)良品種Century(不含脂肪氧化酶-Lox)的近等基因系，推測分離后代中的矮源可能來自Century-2，而對Century-2和Century株高方面的研究尚無報(bào)道。

本研究擬通過對(海系13×北農(nóng)103)F4RHL的F2高稈/矮稈分離群體的遺傳分析，解析高稈/矮稈性狀的遺傳規(guī)律，并利用F2∶3分離群體對其中北農(nóng)103中控制矮稈RHL性狀的基因進(jìn)行分子標(biāo)記與定位，為該基因精細(xì)定位奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1套(海系13×北農(nóng)103)F4RHL的F2分離群體，由北京農(nóng)學(xué)院大豆課題組選育。其中，海系13為南京菜用春大豆品種，株高90 cm；北農(nóng)103為北京市審定的夏播品種，株高55 cm；F2分離群體中高株平均90 cm，矮株平均35 cm。SSR引物，由北京鼎國昌盛有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高稈/矮稈分離群體鑒定與遺傳分析 在大豆鼓粒期對(海系13×北農(nóng)103)F4RHL的F1和F2代高稈/矮稈田間鑒定，并對F2中表現(xiàn)高稈/矮稈分離株系的鑒定結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

1.2.2 大豆基因組DNA提取及分子標(biāo)記 采用CTAB法對(海系13×北農(nóng)103)F4RHL中F2∶3群體的單株葉片進(jìn)行基因組DNA的提取。采用BSA法，根據(jù)田間調(diào)查結(jié)果，分別用F2∶3群體中6個高稈和6個矮稈單株構(gòu)建DNA高稈池和矮稈池，初步篩選控制矮稈基因的分子標(biāo)記；利用(海系13×北農(nóng)103)F4RHL中F2∶3群體對初選標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 PCR擴(kuò)增與電泳 用Bio-Rad PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括正向引物0.5 μL(0.2 μm/L)，反向引物0.5 μL(0.2 μm/L)，PCR Mix 5 μL，DNA模板2 μL(15～25 ng/μL)，ddH2O 2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺=39∶1)電泳的方法進(jìn)行檢測。點(diǎn)樣量為1.8 μL，150 V電泳1.5～2 h。采用快速銀染法染色顯帶，照相后統(tǒng)計(jì)帶型。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析和遺傳作圖 將統(tǒng)計(jì)的帶型用Mapmaker3.0軟件(LOD值取3.0)計(jì)算篩選出的分子標(biāo)記與矮稈基因間遺傳距離；采用MapDrawV2.1軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜；參照大豆遺傳連鎖圖譜(www.soybase.org)進(jìn)行基因定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 高稈/矮稈大豆表型性狀的遺傳分析

注：左為高稈植株，右為矮稈植株。Note:Left is tall plant, Right is dwarf plant.圖1 (海系13×北農(nóng)103)F4RHL的F2株高分離表現(xiàn)Fig.1 (HaiXi 13×BeiNong 103) F2 of F4RHL plant height separation performance

2.2 GmD1基因SSR標(biāo)記的篩選

以大豆(海系13×北農(nóng)103)F4RHL的F2分離群體為分析材料，從中各選取6個髙稈單株和6個 矮稈單株，采用BSA法，建立高稈和矮稈2個近等基因池，利用大豆630對SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜中，分析篩選2個近等基因池間具有多態(tài)性的SSR引物。經(jīng)多次PCR篩選，在630對SSR引物中，獲得25對具有多態(tài)性的引物，占總引物的4%，擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)出2～3條電泳譜帶，在150～300 bp之間。在此基礎(chǔ)上，利用RHLF2高矮稈分離材料中的30個髙稈和30個矮稈單株，繼續(xù)對25對引物的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在25對引物中，9個引物所產(chǎn)生標(biāo)記與GmD1具有連鎖關(guān)系，分別為Satt527，Satt166、Sat_340、Satt481、Sat_150、Sat_245、Satt076、Satt229和Satt664。為進(jìn)一步分析這9對引物產(chǎn)生的標(biāo)記與GmD1的連鎖距離，以(海系13×北農(nóng)103)RHLF2分離群體共201個單株進(jìn)行PCR檢測，其中高稈139個，矮稈62個。檢測結(jié)果表明，9個SSR引物(表1)擴(kuò)增產(chǎn)生標(biāo)記均與矮稈基因GmD1緊密連鎖(表2)，其中3對引物的PCR結(jié)果見圖2。

表1 SSR引物序列Tab.1 The SSR primer for analysis

表2 9個SSR標(biāo)記對(海系13×北農(nóng)103)RHLF2的檢測結(jié)果和與GmD1的遺傳距離Tab.2 Analysised results of HaiXi13×BeiNong103 RHLF2 by 9 SSR markers and genetic distance of GmD1

注：A為高稈純合型；B為矮稈純合型；H為雜合帶型。

Note：A is high plant homozygous genotype; B is dwarf plant homozygous genotype; H is heterozygous genotype.

注：M是標(biāo)記，1是海系13，2 是北農(nóng)103，3-17是矮稈單株，18-32是高稈單株；箭頭指示標(biāo)記位置。Note: M is Maker, 1 is Haixi13, 2 is BeiNong103, 3-17 are Dwarf individuals, 18-32 are High individuals; The arrows indicated the SSR markers .圖2 標(biāo)記Satt481(A)、Sat_245(B)和Sat_150(C)的PCR結(jié)果Fig.2 PCR bySatt481(A), Sat_245(B) and Sat_150(C)

2.3 GmD1基因遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

利用Mapmaker3.0連鎖分析軟件對表1中的9對SSR引物在(海系13×北農(nóng)103)RHLF2分離群體中的201個單株所產(chǎn)生的分子標(biāo)記與矮稈基因GmD1進(jìn)行連鎖分析，并繪制遺傳連鎖圖譜。結(jié)果表明：SSR標(biāo)記Satt527、Satt166、Sat_340、Satt481、Sat_150、Sat_245、Satt076、Satt229和Satt664與GmD1的遺傳距離分別為3.7、4.2、5.2、6.2、6.4、7.9、8.4、11.6、18.5 cM，從遺傳連鎖圖譜(圖3)上可以看出GmD1位于satt166與satt527之間，與9個標(biāo)記的連鎖位置為Satt664-Satt229-Sat_245-Sat_150-Satt481-Sat_340-Satt527-GmD1-Satt166-Satt076。通過對公布的大豆遺傳連鎖圖譜(www.soybase.org)上SSR位點(diǎn)分析，這9個SSR標(biāo)記均在大豆L連鎖群上，故GmD1基因也在L連鎖群上，對應(yīng)大豆第19號染色體。

3 討 論

本研究利用(海系13×北農(nóng)103)F4RHL的F2髙稈和矮稈植株構(gòu)建的分離群體，對其矮稈植株攜帶的矮稈基因進(jìn)行遺傳分析。矮稈性狀受1對隱性基因控制，暫命名為GmD1。進(jìn)而利用SSR分子標(biāo)記結(jié)合BSA方法對GmD1進(jìn)行遺傳連鎖分析，篩選出9個與GmD1連鎖的SSR標(biāo)記，分別為Satt527、Satt166、Sat_340、Satt481、Sat_150、Sat_245、Satt076、Satt229和Satt664，經(jīng)Mapmaker3.0軟件連鎖分析，與GmD1的遺傳距離分別為3.7、4.2、5.2、6.2、6.4、7.9、8.4、11.6、18.5 cM。依據(jù)公布的大豆遺傳連鎖圖譜上SSR標(biāo)記位點(diǎn)分析，GmD1位于大豆L連鎖群上，對應(yīng)大豆第19號染色體。

圖3 大豆矮稈基因GmD1遺傳連鎖圖Fig.3 Genetic linkage map of soybean dwarf gene GmD1

通過對海系13×北農(nóng)103雜交組合的親本株高的表現(xiàn)和系譜分析，GmD1來源于北農(nóng)103，而北農(nóng)103從中黃18種子60Co-γ輻照的衍生后代選育而成，中黃18的雜交組合為中品661×Century-2。Li等[13]用EMS誘變大豆品種中品661，得到1個能明顯降低株高和縮短莖節(jié)尖的DW突變體，認(rèn)為該突變體是由1對隱性核基因控制，定位在大豆8號染色體的460 kb區(qū)域。本研究發(fā)現(xiàn)該突變體基因與本研究發(fā)現(xiàn)的GmD1不在同一連鎖群(染色體)上，并非同一基因。推測GmD1可能是一個新的矮稈基因。

盡管目前關(guān)于大豆矮稈基因的研究有所報(bào)道，但發(fā)現(xiàn)的矮稈基因依然較少，本研究對GmD1的發(fā)現(xiàn)，豐富大豆矮稈基因的類型，同時獲得多個與GmD1緊密連鎖的分子標(biāo)記，為該基因的精細(xì)定位和利用奠定基礎(chǔ)。