異源表達(dá)板栗堅(jiān)果淀粉合成酶基因?qū)λ咀蚜５矸酆铣傻挠绊?/h1>
2019-10-14 08:12:02王玉龍趙永廉劉建玲曹慶芹
北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào) 2019年3期
王玉龍，張 卿，趙永廉，劉建玲，秦 嶺，曹慶芹，邢 宇*
(1a.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/北京林果業(yè)生態(tài)環(huán)境功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，1b. 北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.北京市懷柔區(qū)板栗試驗(yàn)站，北京101405)
板栗(CastaneamollissimaBlume)是殼斗科(Fagaceae)栗屬(Castanea)植物，分布于中國(guó)26個(gè)省(市、區(qū))，適應(yīng)性強(qiáng)，是重要的生態(tài)經(jīng)濟(jì)兼用樹(shù)種[1]。作為以堅(jiān)果為主要經(jīng)濟(jì)來(lái)源的物種，堅(jiān)果的產(chǎn)量及品質(zhì)成為種質(zhì)資源評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。而淀粉是板栗堅(jiān)果的主要成分，是影響堅(jiān)果口感和加工品質(zhì)的主要因素之一。淀粉在板栗堅(jiān)果干物質(zhì)中含量較大，占干重46%～64%[2]。其中直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例對(duì)板栗加工的口感有較大的影響?？剐缘矸?Resistant Starch, RS)是種新型的膳食纖維，它指的是“在健康者小腸中不被吸收的淀粉及淀粉的降解物”[3]。板栗中的抗性淀粉含量較高，可以達(dá)到68.93%，吃板栗可以調(diào)養(yǎng)人體健康狀況[4]。
淀粉合成是一個(gè)復(fù)雜的生化過(guò)程，其主要以光合作用所產(chǎn)生的蔗糖為碳源，經(jīng)水解后以1-磷酸葡萄糖(G1P)的形式進(jìn)入造粉體中[5]。在直鏈淀粉合成酶的催化下，G1P單體的葡糖基通過(guò)α1-4糖苷鍵連接至直鏈淀粉非還原性末端，支鏈淀粉的合成是在淀粉分支酶催化下通過(guò)α1-6糖苷鍵將葡糖基連接至分支點(diǎn)處。這其中還有淀粉脫支酶，異淀粉酶，磷酸化酶等的參與。淀粉的生物合成是多種酶共同作用的結(jié)果。
雖然淀粉在生物體中合成的機(jī)理目前已經(jīng)有比較深入的研究，但是板栗淀粉合成酶基因的功能目前還沒(méi)有得到驗(yàn)證。由于板栗屬于木本植物，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，不易獲得轉(zhuǎn)基因植株；另外，板栗胚性愈傷組織誘導(dǎo)困難、數(shù)量少、周期長(zhǎng)，限制栗屬植物重要基因功能的驗(yàn)證[6]。本試驗(yàn)將水稻作為轉(zhuǎn)基因材料的受體，通過(guò)將板栗可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase, SSS)、淀粉分支酶(starch branching enzyme, SBE)和淀粉去分支酶(pullulanase, PUL)的編碼基因在水稻中過(guò)量表達(dá)，測(cè)定其對(duì)水稻籽粒淀粉含量的影響，以期為板栗淀粉合成酶基因功能的驗(yàn)證提供試驗(yàn)參考。
1 材料與方法
1.1 植物材料
過(guò)表達(dá)中國(guó)板栗SSSII、SSSIII、SSSIV、SBEI、SBEII和PUL基因的轉(zhuǎn)基因水稻‘日本晴(Oryzasativa, Nipponbare)’種子，發(fā)芽后40 d水稻葉片，用于DNA檢測(cè)和RNA表達(dá)量的檢測(cè),成熟水稻種子,用于淀粉含量測(cè)定。
水稻種植地點(diǎn)為海南陵水四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻南繁育種基地。其中過(guò)表達(dá)載體為PBW(1300改進(jìn))載體,轉(zhuǎn)化菌種為EHA105根癌農(nóng)桿菌。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 侵染轉(zhuǎn)化 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將植物過(guò)表達(dá)載體PBW轉(zhuǎn)化到水稻成熟胚愈傷組織獲得轉(zhuǎn)基因水稻幼苗，經(jīng)卡那抗性篩選和PCR擴(kuò)增檢測(cè)獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗，并收獲F1代種子[7]。
1.2.2 試驗(yàn)樣品及處理 分別取轉(zhuǎn)基因株系F1代種子以及轉(zhuǎn)空載體對(duì)照株系種子做催芽處理，每個(gè)株系取催芽萌發(fā)的幼苗200株種植田間。取發(fā)芽后40 d的葉片2～3片作為轉(zhuǎn)基因植株鑒定的材料，采集后迅速置于干冰凍存，置于-80 ℃冰箱保存。水稻成熟后，收割成熟期水稻種子，曬干后保存?zhèn)溆谩?/p>
干種子樣品制備：剝?nèi)シN子穎殼，磨粉后過(guò)0.45 mm篩子，45 ℃烘干備用[8]。每個(gè)樣本3次重復(fù)。
1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè) 剪取1 cm左右的水稻葉片，快速提取基因組DNA[9]，進(jìn)行PCR鑒定。其中PCR引物設(shè)計(jì)使用DNAMAN軟件，上游引物為插入基因序列，下游引物為載體序列，引物信息如表1所示；擴(kuò)增體系為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性1 min，退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株葉片RNA提取及熒光定量PCR檢測(cè) 葉片總RNA提取使用Plant RNA Kit(OMEGA)，DNA消化使用RapidOut DNA Removal Kit(Thermo Scientific)，cDNA的合成使用Reverse transcriptase M-MLV (RNase H)(Takara)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)利用Primer Premier 5軟件，內(nèi)參基因選用水稻18S rRNA基因[10]，引物如表2所示。實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用羅氏Light Cycler96 Real Time PCR系統(tǒng)。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用10 μL反應(yīng)體系，其中SYBR?Premix Ex Taq (Takara)5 μL， ddH2O 2.5 μL，稀釋60倍cDNA 2 μL，上游、下游引物各0.25 μL。反應(yīng)程序：第一步預(yù)變性：95 ℃ 10 min；第二步擴(kuò)增：95 ℃ 20 s，退火20 s，72 ℃ 20 s，39個(gè)循環(huán)；第三步溶解：95 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，97 ℃ 1 s。每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)。
表1 PCR引物列表Tab.1 PCR Primer
表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物列表Tab.2 Real-time Quantitative PCR primer
1.2.5 水稻種子淀粉含量測(cè)定
經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)得到的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，分別檢測(cè)陽(yáng)性植株籽粒的直鏈淀粉、支鏈淀粉、總淀粉和抗性淀粉的含量，并與轉(zhuǎn)空載體對(duì)照株系進(jìn)行比較。直鏈淀粉和支鏈淀粉含量測(cè)定采用Megazyme Amylose/Amylopectin kit檢測(cè)試劑盒[11]，總淀粉含量測(cè)定采用Megazyme total starch kit檢測(cè)試劑盒[12]，抗性淀粉含量測(cè)定采用Megazyme Resistant starch kit檢測(cè)試劑盒[13]，每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系測(cè)定3株，每個(gè)樣品測(cè)量3次，取平均值。
1.3 數(shù)據(jù)分析
采用Microsoft Excel繪制圖表，計(jì)算平均數(shù)；利用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析和顯著性分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 轉(zhuǎn)基因水稻株系篩選
PCR擴(kuò)增檢測(cè)F2代水稻葉片外源基因，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。CmSSSII、CmSSSIV、CmSBEI和CmPUL轉(zhuǎn)基因水稻株系均擴(kuò)增出相應(yīng)片段大小的條帶，且檢測(cè)到3個(gè)以上陽(yáng)性植株，表明這些植株均攜帶外源基因。而CmSSSIII和CmSBEII轉(zhuǎn)基因水稻株系未擴(kuò)增出目的條帶，表明植株為非陽(yáng)性植株，未攜帶外源基因。
注：M表示Marker，1-3表示樣本。Note：M is Marks , 1-3 means every sample.圖1 轉(zhuǎn)基因水稻葉片的PCR檢測(cè)Fig.1 PCR detection of transgenic rice leaves
2.2 轉(zhuǎn)基因水稻中外源基因的表達(dá)量分析
為了檢測(cè)外源基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)情況，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻葉片進(jìn)行檢測(cè)。外源基因CmSSSII、CmSSSIV、CmSBEI和CmPUL對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片的表達(dá)量顯著高于轉(zhuǎn)空載體水稻葉片的表達(dá)量。同時(shí)，外源基因在轉(zhuǎn)空載體水稻葉片中均有少量的表達(dá)(圖2)，可能是由于水稻基因組中含有與板栗同源性較高的基因序列。
2.3 轉(zhuǎn)基因水稻植株的株型分析
在F2代轉(zhuǎn)基因水稻發(fā)芽后60 d(圖3)，統(tǒng)計(jì)水稻植株的株高、穗長(zhǎng)、劍葉長(zhǎng)、劍葉寬、分蘗數(shù)和籽粒千粒重(表3)。與轉(zhuǎn)空載體對(duì)照株系相比，CmSSSII轉(zhuǎn)基因株系分蘗數(shù)顯著升高、籽粒千粒重顯著降低，CmSSSIV轉(zhuǎn)基因株系分蘗數(shù)顯著升高，CmSBEI轉(zhuǎn)基因株系籽粒千粒重顯著降低，CmPUL轉(zhuǎn)基因株系的株型沒(méi)有顯著變化。
注：每組柱形圖分別為轉(zhuǎn)空載體和三個(gè)轉(zhuǎn)基因樣本；**表示與轉(zhuǎn)空載體對(duì)比差異極顯著(P<0.01)。Note：Each group of column means the trans empty vector and three transgenic samples ; ** indicates a highly significant level of variation compared to the trans empty vector transgenic rice line (P<0.01).圖2 目的基因在轉(zhuǎn)基因水稻植株中的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression level of target genes in transgenic rice samples
圖3 轉(zhuǎn)基因水稻的株型Fig.3 Plant shape of transgenic rice
名稱(chēng)Name株高/cmPlant height穗長(zhǎng)/cmEar length劍葉長(zhǎng)/cmFlag leaf length劍葉寬/cmFlag leaf width分蘗數(shù)/(個(gè)/穴)Tiller number籽粒千粒重/g1000-grain weight轉(zhuǎn)空載體Trans empty vector 62.83±5.5610.57±1.5615.67±1.370.80±0.0643.00±3.4722.9±0.15SSS II53.80±4.49**10.64±0.3615.20±1.300.90±0.0753.60±4.04**20.1±0.35**SSS IV62.40±3.6411.64±1.7016.80±0.840.90±0.1266.00±6.32**22.4±0.28SBE I59.00±2.2410.14±0.3115.00±0.710.84±0.0947.00±5.2421.3±0.39**PUL58.40±2.7012.64±0.8414.40±0.550.96±0.1850.60±3.0523.3±0.28
注：**表示轉(zhuǎn)空載體相比差異極顯著(P<0.01)。
Note：** indicates a highly significant level of variation compared to the trans empty vector transgenic rice line (P<0.01).
2.4 轉(zhuǎn)基因水稻淀粉含量變化
收獲轉(zhuǎn)基因水稻成熟種子，測(cè)定其直鏈淀粉、支鏈淀粉、總淀粉和抗性淀粉含量。CmSSSII轉(zhuǎn)基因水稻種子直鏈淀粉含量顯著高于轉(zhuǎn)空載體水稻種子直鏈淀粉含量，而CmSBEI轉(zhuǎn)基因水稻種子直鏈淀粉含量顯著低于轉(zhuǎn)空載體水稻種子直鏈淀粉含量；CmSSSII和CmSBEI轉(zhuǎn)基因水稻種子支鏈淀粉含量顯著高于轉(zhuǎn)空載體水稻種子支鏈淀粉含量；CmSSSII、CmSBEI和轉(zhuǎn)基因水稻種子總淀粉含量顯著高于轉(zhuǎn)空載體對(duì)照水稻種子總淀粉含量，其中CmSSSII轉(zhuǎn)基因水稻株系總淀粉含量升高的原因是由于直鏈淀粉和支鏈淀粉均升高所致，而CmSBEI轉(zhuǎn)基因水稻株系總淀粉含量升高的原因是由于支鏈淀粉含量的升高程度大于直鏈淀粉含量的降低；CmSSSII和CmSBEI轉(zhuǎn)基因水稻種子抗性淀粉含量顯著高于轉(zhuǎn)空載體水稻種子抗性淀粉含量(圖4)。
注：**表示與轉(zhuǎn)空載體株系相比差異極顯著(P<0.01)。Note:** indicates a highly significant level of variation compared to the trans empty vector transgenic rice line (P<0.01).圖4 不同轉(zhuǎn)基因水稻株系種子直鏈淀粉、支鏈淀粉、總淀粉和抗性淀粉含量Fig.4 Percentage content of amylase, amylopectin, total starch and resistant starch in the grain of different transgenic rice lines
3 討 論
淀粉含量是評(píng)價(jià)板栗品質(zhì)的重要指標(biāo)，直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例對(duì)板栗的口感有較大的影響，梁麗松等系統(tǒng)研究板栗淀粉糊化特性與直鏈淀粉含量及淀粉粒粒徑之間的關(guān)系[14]，陳良珂等研究板栗堅(jiān)果不同發(fā)育時(shí)期的淀粉積累規(guī)律及其特性，同時(shí)挖掘影響支鏈淀粉合成的關(guān)鍵基因[15]，但對(duì)于板栗淀粉合成關(guān)鍵酶的基因功能未進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證工作。SSS基因作為淀粉合成酶的關(guān)鍵基因，主要參與直鏈淀粉的合成[16]，在本試驗(yàn)中，CmSSSII基因過(guò)量表達(dá)使水稻籽粒直鏈淀粉含量和總淀粉含量顯著升高，這與Bin Tian等[17]對(duì)SSS基因的功能驗(yàn)證相符合。
SBE為支鏈淀粉合成酶，不但參與催化支鏈淀粉分支的形成，而且在分支的非還原末端添加單糖殘基，決定淀粉分支的類(lèi)型和支鏈淀粉含量[18]，在本研究中，CmSBEI基因過(guò)量表達(dá)使水稻種子支鏈淀粉含量、總淀粉含量和抗性淀粉含量顯著增高，直鏈淀粉含量顯著降低。與David A Brummell等[19]的相關(guān)報(bào)道相符合。
在水稻中，PUL屬于DBE即淀粉脫支酶家族的成員，主要參與支鏈淀粉的去分支化[20]，在本研究中，CmPUL基因過(guò)量表達(dá)對(duì)水稻種子淀粉含量沒(méi)有顯著影響。
CmSSSII和CmSBEI基因的功能與其他物種中的同源基因功能驗(yàn)證的結(jié)果相符合。CmSSSIII和CmSBEII轉(zhuǎn)基因株系未能鑒定到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，可能是該基因在水稻中過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致水稻的敗育，無(wú)法獲得下一代水稻轉(zhuǎn)基因株系。CmSSSIV、CmPUL轉(zhuǎn)基因株系已鑒定到陽(yáng)性植株卻沒(méi)有表型上的變化，可能是該基因在不同宿主中未表達(dá)，導(dǎo)致該基因未能發(fā)揮功能。本試驗(yàn)僅初步探討板栗淀粉合成酶基因的功能，為了更進(jìn)一步驗(yàn)證問(wèn)題，還需深入的研究。
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淀粉合成是一個(gè)復(fù)雜的生化過(guò)程，其主要以光合作用所產(chǎn)生的蔗糖為碳源，經(jīng)水解后以1-磷酸葡萄糖(G1P)的形式進(jìn)入造粉體中[5]。在直鏈淀粉合成酶的催化下，G1P單體的葡糖基通過(guò)α1-4糖苷鍵連接至直鏈淀粉非還原性末端，支鏈淀粉的合成是在淀粉分支酶催化下通過(guò)α1-6糖苷鍵將葡糖基連接至分支點(diǎn)處。這其中還有淀粉脫支酶，異淀粉酶，磷酸化酶等的參與。淀粉的生物合成是多種酶共同作用的結(jié)果。
雖然淀粉在生物體中合成的機(jī)理目前已經(jīng)有比較深入的研究，但是板栗淀粉合成酶基因的功能目前還沒(méi)有得到驗(yàn)證。由于板栗屬于木本植物，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，不易獲得轉(zhuǎn)基因植株；另外，板栗胚性愈傷組織誘導(dǎo)困難、數(shù)量少、周期長(zhǎng)，限制栗屬植物重要基因功能的驗(yàn)證[6]。本試驗(yàn)將水稻作為轉(zhuǎn)基因材料的受體，通過(guò)將板栗可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase, SSS)、淀粉分支酶(starch branching enzyme, SBE)和淀粉去分支酶(pullulanase, PUL)的編碼基因在水稻中過(guò)量表達(dá)，測(cè)定其對(duì)水稻籽粒淀粉含量的影響，以期為板栗淀粉合成酶基因功能的驗(yàn)證提供試驗(yàn)參考。
1 材料與方法
1.1 植物材料
過(guò)表達(dá)中國(guó)板栗SSSII、SSSIII、SSSIV、SBEI、SBEII和PUL基因的轉(zhuǎn)基因水稻‘日本晴(Oryzasativa, Nipponbare)’種子，發(fā)芽后40 d水稻葉片，用于DNA檢測(cè)和RNA表達(dá)量的檢測(cè),成熟水稻種子,用于淀粉含量測(cè)定。
水稻種植地點(diǎn)為海南陵水四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻南繁育種基地。其中過(guò)表達(dá)載體為PBW(1300改進(jìn))載體,轉(zhuǎn)化菌種為EHA105根癌農(nóng)桿菌。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 侵染轉(zhuǎn)化 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將植物過(guò)表達(dá)載體PBW轉(zhuǎn)化到水稻成熟胚愈傷組織獲得轉(zhuǎn)基因水稻幼苗，經(jīng)卡那抗性篩選和PCR擴(kuò)增檢測(cè)獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗，并收獲F1代種子[7]。
1.2.2 試驗(yàn)樣品及處理 分別取轉(zhuǎn)基因株系F1代種子以及轉(zhuǎn)空載體對(duì)照株系種子做催芽處理，每個(gè)株系取催芽萌發(fā)的幼苗200株種植田間。取發(fā)芽后40 d的葉片2～3片作為轉(zhuǎn)基因植株鑒定的材料，采集后迅速置于干冰凍存，置于-80 ℃冰箱保存。水稻成熟后，收割成熟期水稻種子，曬干后保存?zhèn)溆谩?/p>
干種子樣品制備：剝?nèi)シN子穎殼，磨粉后過(guò)0.45 mm篩子，45 ℃烘干備用[8]。每個(gè)樣本3次重復(fù)。
1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè) 剪取1 cm左右的水稻葉片，快速提取基因組DNA[9]，進(jìn)行PCR鑒定。其中PCR引物設(shè)計(jì)使用DNAMAN軟件，上游引物為插入基因序列，下游引物為載體序列，引物信息如表1所示；擴(kuò)增體系為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性1 min，退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株葉片RNA提取及熒光定量PCR檢測(cè) 葉片總RNA提取使用Plant RNA Kit(OMEGA)，DNA消化使用RapidOut DNA Removal Kit(Thermo Scientific)，cDNA的合成使用Reverse transcriptase M-MLV (RNase H)(Takara)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)利用Primer Premier 5軟件，內(nèi)參基因選用水稻18S rRNA基因[10]，引物如表2所示。實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用羅氏Light Cycler96 Real Time PCR系統(tǒng)。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用10 μL反應(yīng)體系，其中SYBR?Premix Ex Taq (Takara)5 μL， ddH2O 2.5 μL，稀釋60倍cDNA 2 μL，上游、下游引物各0.25 μL。反應(yīng)程序：第一步預(yù)變性：95 ℃ 10 min；第二步擴(kuò)增：95 ℃ 20 s，退火20 s，72 ℃ 20 s，39個(gè)循環(huán)；第三步溶解：95 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，97 ℃ 1 s。每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)。
表1 PCR引物列表Tab.1 PCR Primer
表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物列表Tab.2 Real-time Quantitative PCR primer
1.2.5 水稻種子淀粉含量測(cè)定
經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)得到的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，分別檢測(cè)陽(yáng)性植株籽粒的直鏈淀粉、支鏈淀粉、總淀粉和抗性淀粉的含量，并與轉(zhuǎn)空載體對(duì)照株系進(jìn)行比較。直鏈淀粉和支鏈淀粉含量測(cè)定采用Megazyme Amylose/Amylopectin kit檢測(cè)試劑盒[11]，總淀粉含量測(cè)定采用Megazyme total starch kit檢測(cè)試劑盒[12]，抗性淀粉含量測(cè)定采用Megazyme Resistant starch kit檢測(cè)試劑盒[13]，每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系測(cè)定3株，每個(gè)樣品測(cè)量3次，取平均值。
1.3 數(shù)據(jù)分析
采用Microsoft Excel繪制圖表，計(jì)算平均數(shù)；利用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析和顯著性分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 轉(zhuǎn)基因水稻株系篩選
PCR擴(kuò)增檢測(cè)F2代水稻葉片外源基因，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。CmSSSII、CmSSSIV、CmSBEI和CmPUL轉(zhuǎn)基因水稻株系均擴(kuò)增出相應(yīng)片段大小的條帶，且檢測(cè)到3個(gè)以上陽(yáng)性植株，表明這些植株均攜帶外源基因。而CmSSSIII和CmSBEII轉(zhuǎn)基因水稻株系未擴(kuò)增出目的條帶，表明植株為非陽(yáng)性植株，未攜帶外源基因。
注：M表示Marker，1-3表示樣本。Note：M is Marks , 1-3 means every sample.圖1 轉(zhuǎn)基因水稻葉片的PCR檢測(cè)Fig.1 PCR detection of transgenic rice leaves
2.2 轉(zhuǎn)基因水稻中外源基因的表達(dá)量分析
為了檢測(cè)外源基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)情況，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻葉片進(jìn)行檢測(cè)。外源基因CmSSSII、CmSSSIV、CmSBEI和CmPUL對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片的表達(dá)量顯著高于轉(zhuǎn)空載體水稻葉片的表達(dá)量。同時(shí)，外源基因在轉(zhuǎn)空載體水稻葉片中均有少量的表達(dá)(圖2)，可能是由于水稻基因組中含有與板栗同源性較高的基因序列。
2.3 轉(zhuǎn)基因水稻植株的株型分析
在F2代轉(zhuǎn)基因水稻發(fā)芽后60 d(圖3)，統(tǒng)計(jì)水稻植株的株高、穗長(zhǎng)、劍葉長(zhǎng)、劍葉寬、分蘗數(shù)和籽粒千粒重(表3)。與轉(zhuǎn)空載體對(duì)照株系相比，CmSSSII轉(zhuǎn)基因株系分蘗數(shù)顯著升高、籽粒千粒重顯著降低，CmSSSIV轉(zhuǎn)基因株系分蘗數(shù)顯著升高，CmSBEI轉(zhuǎn)基因株系籽粒千粒重顯著降低，CmPUL轉(zhuǎn)基因株系的株型沒(méi)有顯著變化。
注：每組柱形圖分別為轉(zhuǎn)空載體和三個(gè)轉(zhuǎn)基因樣本；**表示與轉(zhuǎn)空載體對(duì)比差異極顯著(P<0.01)。Note：Each group of column means the trans empty vector and three transgenic samples ; ** indicates a highly significant level of variation compared to the trans empty vector transgenic rice line (P<0.01).圖2 目的基因在轉(zhuǎn)基因水稻植株中的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression level of target genes in transgenic rice samples
圖3 轉(zhuǎn)基因水稻的株型Fig.3 Plant shape of transgenic rice
名稱(chēng)Name株高/cmPlant height穗長(zhǎng)/cmEar length劍葉長(zhǎng)/cmFlag leaf length劍葉寬/cmFlag leaf width分蘗數(shù)/(個(gè)/穴)Tiller number籽粒千粒重/g1000-grain weight轉(zhuǎn)空載體Trans empty vector 62.83±5.5610.57±1.5615.67±1.370.80±0.0643.00±3.4722.9±0.15SSS II53.80±4.49**10.64±0.3615.20±1.300.90±0.0753.60±4.04**20.1±0.35**SSS IV62.40±3.6411.64±1.7016.80±0.840.90±0.1266.00±6.32**22.4±0.28SBE I59.00±2.2410.14±0.3115.00±0.710.84±0.0947.00±5.2421.3±0.39**PUL58.40±2.7012.64±0.8414.40±0.550.96±0.1850.60±3.0523.3±0.28
注：**表示轉(zhuǎn)空載體相比差異極顯著(P<0.01)。
Note：** indicates a highly significant level of variation compared to the trans empty vector transgenic rice line (P<0.01).
2.4 轉(zhuǎn)基因水稻淀粉含量變化
收獲轉(zhuǎn)基因水稻成熟種子，測(cè)定其直鏈淀粉、支鏈淀粉、總淀粉和抗性淀粉含量。CmSSSII轉(zhuǎn)基因水稻種子直鏈淀粉含量顯著高于轉(zhuǎn)空載體水稻種子直鏈淀粉含量，而CmSBEI轉(zhuǎn)基因水稻種子直鏈淀粉含量顯著低于轉(zhuǎn)空載體水稻種子直鏈淀粉含量；CmSSSII和CmSBEI轉(zhuǎn)基因水稻種子支鏈淀粉含量顯著高于轉(zhuǎn)空載體水稻種子支鏈淀粉含量；CmSSSII、CmSBEI和轉(zhuǎn)基因水稻種子總淀粉含量顯著高于轉(zhuǎn)空載體對(duì)照水稻種子總淀粉含量，其中CmSSSII轉(zhuǎn)基因水稻株系總淀粉含量升高的原因是由于直鏈淀粉和支鏈淀粉均升高所致，而CmSBEI轉(zhuǎn)基因水稻株系總淀粉含量升高的原因是由于支鏈淀粉含量的升高程度大于直鏈淀粉含量的降低；CmSSSII和CmSBEI轉(zhuǎn)基因水稻種子抗性淀粉含量顯著高于轉(zhuǎn)空載體水稻種子抗性淀粉含量(圖4)。
注：**表示與轉(zhuǎn)空載體株系相比差異極顯著(P<0.01)。Note:** indicates a highly significant level of variation compared to the trans empty vector transgenic rice line (P<0.01).圖4 不同轉(zhuǎn)基因水稻株系種子直鏈淀粉、支鏈淀粉、總淀粉和抗性淀粉含量Fig.4 Percentage content of amylase, amylopectin, total starch and resistant starch in the grain of different transgenic rice lines
3 討 論
淀粉含量是評(píng)價(jià)板栗品質(zhì)的重要指標(biāo)，直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例對(duì)板栗的口感有較大的影響，梁麗松等系統(tǒng)研究板栗淀粉糊化特性與直鏈淀粉含量及淀粉粒粒徑之間的關(guān)系[14]，陳良珂等研究板栗堅(jiān)果不同發(fā)育時(shí)期的淀粉積累規(guī)律及其特性，同時(shí)挖掘影響支鏈淀粉合成的關(guān)鍵基因[15]，但對(duì)于板栗淀粉合成關(guān)鍵酶的基因功能未進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證工作。SSS基因作為淀粉合成酶的關(guān)鍵基因，主要參與直鏈淀粉的合成[16]，在本試驗(yàn)中，CmSSSII基因過(guò)量表達(dá)使水稻籽粒直鏈淀粉含量和總淀粉含量顯著升高，這與Bin Tian等[17]對(duì)SSS基因的功能驗(yàn)證相符合。
SBE為支鏈淀粉合成酶，不但參與催化支鏈淀粉分支的形成，而且在分支的非還原末端添加單糖殘基，決定淀粉分支的類(lèi)型和支鏈淀粉含量[18]，在本研究中，CmSBEI基因過(guò)量表達(dá)使水稻種子支鏈淀粉含量、總淀粉含量和抗性淀粉含量顯著增高，直鏈淀粉含量顯著降低。與David A Brummell等[19]的相關(guān)報(bào)道相符合。
在水稻中，PUL屬于DBE即淀粉脫支酶家族的成員，主要參與支鏈淀粉的去分支化[20]，在本研究中，CmPUL基因過(guò)量表達(dá)對(duì)水稻種子淀粉含量沒(méi)有顯著影響。
CmSSSII和CmSBEI基因的功能與其他物種中的同源基因功能驗(yàn)證的結(jié)果相符合。CmSSSIII和CmSBEII轉(zhuǎn)基因株系未能鑒定到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，可能是該基因在水稻中過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致水稻的敗育，無(wú)法獲得下一代水稻轉(zhuǎn)基因株系。CmSSSIV、CmPUL轉(zhuǎn)基因株系已鑒定到陽(yáng)性植株卻沒(méi)有表型上的變化，可能是該基因在不同宿主中未表達(dá)，導(dǎo)致該基因未能發(fā)揮功能。本試驗(yàn)僅初步探討板栗淀粉合成酶基因的功能，為了更進(jìn)一步驗(yàn)證問(wèn)題，還需深入的研究。
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