某院CRAB同源性及其生物膜形成能力分析

曾 婷，曾 凌，曹先偉，鄧 瓊，張 杰

(1. 南昌大學公共衛(wèi)生學院，江西 南昌 330006； 2.江西省預防醫(yī)學重點實驗室，江西 南昌 330006； 3. 南昌大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)院感染管理科，江西 南昌 330006； 4. 南昌大學醫(yī)學院，江西 南昌 330006)

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii，AB)是一種非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，能夠引起廣泛的醫(yī)院感染。碳青霉烯類藥物具有廣泛的抗菌譜和較強的抗菌活性，是治療AB首選藥物。隨著碳青霉烯類藥物的普遍使用，以及AB固有的或獲得性耐藥特性，導致了耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(carba-penem-resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB)的克隆廣泛流行[1]。CHINET監(jiān)測網(wǎng)監(jiān)測結(jié)果顯示，AB對美羅培南和亞胺培南的耐藥率從2014年的66.7%和62.4%，分別上升至2018年的78.1%和77.1%[2]。AB的耐藥與其具有生物膜形成能力有關(guān)，研究[3]顯示，42%的臨床分離菌具有生物膜形成能力，且大部分產(chǎn)膜菌為多重耐藥菌，生物膜形成能力在不同克隆菌株之間也存在差異[4]，給臨床防控CRAB帶來了更大的挑戰(zhàn)。對某院32株CRAB進行研究，旨在了解CRAB主要流行克隆型和生物膜形成能力，以及生物膜形成能力與克隆型、耐藥率之間的關(guān)系，以期完善CRAB的防控措施，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2017年2—10月某三甲綜合醫(yī)院各臨床科室送檢分離的32株非重復CRAB菌株，所有菌株均經(jīng)VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定。

1.1.3 主要儀器與試劑 VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀及配套的藥敏紙片、恒溫培養(yǎng)箱、比濁儀、搖床、PFGE電泳儀、酶標儀、凝膠成像系統(tǒng)、96孔聚苯乙烯滅菌板、磷酸鹽緩沖液(PBS)、無水乙醇、1%結(jié)晶紫、限制性內(nèi)切酶XbaI和ApaI、PFGE專用瓊脂糖凝膠。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 試驗菌株純化后采用VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)進行藥物敏感性檢測，參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會[5](CLSI)2018年版制定的標準對檢測結(jié)果進行判讀。大腸埃希菌ATCC 25922為質(zhì)控菌株。

1.2.2 PFGE同源性分析 將37℃培養(yǎng)過夜的CRAB菌落刮置CSB緩沖液中，用比濁儀調(diào)整菌懸液的濃度，菌懸液經(jīng)1% Seakem Gold瓊脂糖凝膠包被、蛋白酶K消化和限制性內(nèi)切酶ApaI酶切后在CHEF-DR II電泳儀中進行脈沖場凝膠電泳。電泳條件：緩沖液溫度14℃，電場強度6 V/cm，電場夾角120度，脈沖轉(zhuǎn)換時間2.2～63.8 s，電泳時間16 h。電泳結(jié)束后用GelRed核酸染料染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照保存。參照美國疾病控制與預防中心(CDC)研究員Tenower[6]推薦的方法對PFGE結(jié)果進行判讀：條帶完全一致定義為同一型別，1～3條條帶存在差異定義為同一型別的不同亞型，3條以上條帶存在差異定義為不同型別。使用BioNumerics軟件對PFGE圖譜進行聚類分析，繪制樹狀圖。

1.2.3 結(jié)晶紫染色法測定生物膜形成能力 參照相關(guān)文獻[7-8]，將處于對數(shù)生長期的32株CRAB菌落接種于96孔聚苯乙烯滅菌板中，200 μL/孔，3孔/株，空白培養(yǎng)基作為陰性對照。將96孔板置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h后，小心地將菌液吸出，磷酸鹽緩沖液(PBS)反復清洗，室溫晾干后每孔加入200 μL的1%結(jié)晶紫染液染色20 min，滅菌蒸餾水將染液洗凈，室溫晾干后每孔加入200 μL無水乙醇溶解結(jié)晶紫10 min，用酶標儀測定每孔在570 nm處的吸光度(A)值,以3孔A值的平均值為每株菌的最終A值。生物膜形成能力結(jié)果判定[9]：測定空白培養(yǎng)基的最終A值，定義AC=A+3S，將待測菌株的最終A值與AC進行比較，陰性(-)：A≤AC，無被膜形成；弱陽性(+)：AC4AC，強被膜形成。

1.3 統(tǒng)計方法 應用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用構(gòu)成比描述，χ2檢驗或秩和檢驗，P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株來源 32株CRAB分離自32例患者，其中男性26例(81.3%)，女性6例(18.7%)，平均年齡(51.34±19.54)歲，45～60歲患者13例(40.6%)。CRAB標本主要分離自痰(46.9%)，科室主要分布于新生兒重癥監(jiān)護病房(NICU，43.8%)。見表1。

2.2 PFGE電泳結(jié)果 PFGE圖譜經(jīng)聚類分析結(jié)果顯示，32株CRAB可分為9個不同克隆型，分別為A～I型，A型為主要克隆型(9株)，E型7株，B型和C型各4株，D型、F型和G型各2株，H型和I型各1株。見圖1。

2.3 生物膜形成結(jié)果 陰性對照組AC=A+3S=0.080+3×0.007=0.101, 將32株CRAB的最終A值與AC值比較，結(jié)果顯示有14株具有生物膜形成能力，占43.8%，且均為弱陽性。

2.4 生物膜形成能力與不同克隆型的分析 將不同克隆型內(nèi)各菌株最終A值與AC值比較，各克隆型菌株的生物膜形成能力見表2。各克隆型間生物膜形成能力比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=6.636，P=0.659)。

表1 32例CRAB感染患者基本特征

圖1 32株CRAB的PFGE聚類分析結(jié)果

表2 不同CRAB克隆型生物膜形成能力分布

表3 32株CRAB生物膜形成能力與耐藥性分析

3 討論

AB對外界環(huán)境適應能力強，能夠長期存在于空調(diào)、病床、導管、呼吸機等環(huán)境中，可引起血流感染、泌尿系統(tǒng)感染和醫(yī)院獲得性肺炎等[10]。目前，AB因多重耐藥和高檢出率被認為是威脅全球衛(wèi)生保健系統(tǒng)的七大病原體之一[11]，引起了人們的廣泛關(guān)注。本研究32例CRAB患者平均年齡為(51.34±19.54)歲，標本主要分離于痰，提示呼吸系統(tǒng)是CRAB最容易感染的部位。32株CRAB均為多重耐藥菌，對常用抗菌藥物的耐藥率均高于65%，限制了其感染臨床治療的藥物選擇。

PFGE具有結(jié)果穩(wěn)定、重復性好、分辨率高、易于標準化等優(yōu)點，是國際上公認的分子生物學分型技術(shù)的“金標準”，被廣泛用于鑒定感染暴發(fā)或追蹤流行[12]。PFGE研究結(jié)果顯示，32株CRAB可分為9個不同克隆型，分別為A～I型，A型為主要克隆型(9株)，E型7株，B型和C型各4株，D型、F型和G型各2株，H型和I型各1株。E型的A2菌株和A3菌株均為NICU患者，且住院時間有交叉，提示在NICU出現(xiàn)了同型別CRAB的感染，造成此現(xiàn)象可能與共用醫(yī)療器械相關(guān)。A型菌株傳播的時間跨度最長，從2017年2月23日首次檢出到2017年10月27日末次檢出長達8個月，提示A型菌株長期存在于醫(yī)院，并通過某些途徑造成了交叉感染，但當時并未及時追蹤溯源。為減少CRAB的交叉感染，應進一步加強醫(yī)院環(huán)境的清潔與消毒，嚴格執(zhí)行手衛(wèi)生，完善接觸隔離制度，醫(yī)務人員應嚴格遵守無菌操作和感染控制規(guī)范[13]。

生物膜是指不可逆地黏附在物體表面，并被細菌自身基質(zhì)包裹的細菌群落[14]。本研究使用結(jié)晶紫染色法對32株CRAB進行檢測，發(fā)現(xiàn)其中14株具有生物膜形成能力且均為弱陽性。不同克隆型間生物膜的形成能力差異無統(tǒng)計學意義，與尹珍等[4]研究結(jié)果不一致，可能是不同地區(qū)間CRAB的傳播差異所致。將生物膜陰性組和陽性組比較，發(fā)現(xiàn)陽性組的耐藥率均有不同程度地升高，與相關(guān)研究[15-16]結(jié)果一致。具有生物膜形成能力的CRAB可通過以下兩種機制提高細菌耐藥性[17-18]：(1)生物膜的滲透限制，生物膜中高密度的細菌可以產(chǎn)生阻礙抗菌藥物滲透的細胞外基質(zhì)；(2)生物膜的營養(yǎng)限制，生物膜中的細菌維持在低代謝和緩慢生長的狀態(tài)，使其對外界刺激如抗菌藥物不敏感。掌握CRAB生物膜的產(chǎn)生與否，以及產(chǎn)膜菌的耐藥模式，有助于完善抗菌藥物使用政策。臨床上應提高生物膜檢測水平，更合理的選擇抗菌藥物，減少耐藥發(fā)生[19]。

綜上所述，該院CRAB耐藥形勢嚴峻，且存在以A型和E型為主的不同克隆型傳播，生物膜形成能力的增強能提高菌株的耐藥性，治療時應優(yōu)先選擇具有清除生物膜作用的抗菌藥物，減少CRAB醫(yī)院感染的發(fā)生。