柱前衍生化高效液相色譜法測定他達拉非中氯乙酸殘留量

徐 然

（江蘇省南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院，江蘇 南京 211100）

他達拉非（tadalafil）為口服磷酸二酯酶 V型（PDE5）抑制劑，用于治療男性勃起功能障礙（MED）。根據(jù)現(xiàn)有他達拉非合成路徑［1-3］，氯乙酸是他達拉非中可能殘留的特殊雜質。氯乙酸含有基因毒性警示結構，具有潛在基因毒性［4］。歐洲藥品管理局（EMEA）、美國食品藥品管理局（FDA）及人用藥品注冊技術要求國際協(xié)調會（ICH）先后頒布了基因毒性雜質控制的指導文件，均推薦以毒理學關注閾值（TTC，1.5 μg/d）來控制用藥風險［5］?；赥TC，以他達拉非最大口服劑量20 mg/d計算，氯乙酸限度須不超過75×10-6，故需建立專屬高靈敏度好的分析方法測定他達拉非中的氯乙酸殘留量。以往研究中主要采用高效液相色譜（HPLC）法對他達拉非的含量［6］、有關物質［7］及異構體雜質［8］進行控制。目前，對于測定水環(huán)境中氯乙酸的殘留，主要采用離子色譜法［9］和衍生化氣相色譜法［10］，尚未見有藥物基質中氯乙酸殘留的測定報道。本研究中采用2-硝基苯肼與氯乙酸中的羰基在催化劑作用下發(fā)生縮合反應［11-12］，將其轉化為具有較強紫外吸收的衍生化產(chǎn)物，進而采用HPLC法進行測定。

1 儀器與試藥

儀器：LC-20AT型高效液相色譜儀（配置LC-Solution色譜工作站，日本島津公司）；XS205型電子天平（瑞士梅特勒-托利多國際有限公司，分度值為0.1mg）。

試藥：氯乙酸（MCAA，純度為98%，昀冠＜上海＞生物科技有限公司）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl，純度為97%，國藥集團化學試劑有限公司）；2-硝基苯肼鹽酸鹽（2-NPH·HCl，純度為97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；他達拉非原料藥（南京海融醫(yī)藥科技股份有限公司，純度大于 99% ，批號分別為 20170301，20170302，20170303）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A 相）-0.1%磷酸溶液（B 相），梯度洗脫，0 min 30%A ～70%B、12 min 55%A ～45%B；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：392 nm。

2.2 溶液制備

取氯乙酸約10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用80%乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為氯乙酸貯備液。精密量取一定量的氯乙酸貯備液，用80%乙腈逐級稀釋，配制成氯乙酸對照溶液。取2-硝基苯肼鹽酸鹽100 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用80%乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為衍生化試液。取1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽100 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為催化劑溶液。

圖1 衍生化反應影響因素

2.3 衍生化步驟

空白溶液衍生化反應：精密量取80%乙腈200 μL，置10 mL容量瓶中，再加入500 μL衍生化試液，500 μL催化劑溶液，加70%乙腈稀釋至刻度，搖勻。室溫反應1 h后取20 μL進樣。

對照品溶液衍生化反應：精密量取氯乙酸對照溶液200 μL，置 10 mL 容量瓶中，再加入 500 μL 衍生化試液，500 μL催化劑溶液，加80%乙腈稀釋至刻度，搖勻。室溫反應1 h后取20 μL進樣。

供試品溶液衍生化反應：取他達拉非原料藥20 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加入500 μL衍生化試液，500 μL催化劑溶液，加80%乙腈稀釋至刻度，搖勻，室溫反應1 h，取20 μL進樣。

2.4 衍生化條件優(yōu)化

為了確保衍生化反應快速進行，在室溫反應條件下，選擇單因素試驗設計法，對體系中衍生化試劑的用量、有機相的比例、反應時間和反應體系pH等因素進行考察。以生成的衍生化產(chǎn)物的峰面積（1 μg/mL）為指標，考察了不同質量濃度的2-硝基苯肼鹽酸鹽（0.20，0.50，0.80，1.00，1.25 g/L）、乙腈比例（10% ，30% ，50% ，70% ，90% ）、反應時間（1，2，3，5，7 h）、反應體系pH（4.0，5.0，6.0，7.0，8.0）對衍生化反應效率的影響，結果見圖1?？梢姡斊渌麠l件相同時，衍生化試劑質量濃度在0.80～1.25 g/L范圍的2-硝基苯肼足以使衍生化反應完全，因此將加入的衍生化試劑的質量濃度設為1.00 g/L；當反應體系中乙腈比例達到70%、反應時間為2 h時，衍生化產(chǎn)物的響應達到最佳，而反應液pH在考察范圍內(nèi)，衍生化產(chǎn)物的峰面積變化不大，因此選擇不調整反應液pH直接反應。最終確定衍生化反應條件為與2-硝基苯肼（1.00 g/L）衍生化2 h后直接進樣，反應體系乙腈比例為70%。

2.5 檢測波長選擇

氯乙酸與2-硝基苯肼反應產(chǎn)物的檢測波長見圖2。雖然在低波長處吸光度較強，但色譜圖中的干擾也較嚴重。選擇392 nm為檢測波長時，他達拉非及其有關物質無明顯吸收，色譜圖基線干擾較少，檢測靈敏度高。

圖2 紫外光譜圖

2.6 方法學考察

專屬性試驗：分別進樣不含氯乙酸的空白衍生化反應溶液、2 g/L他達拉非的衍生化反應溶液、100 ng/mL氯乙酸的衍生化反應溶液（不含催化劑）和100 ng/mL氯乙酸的衍生化反應溶液（含催化劑），結果見圖3。可見，氯乙酸在催化劑存在的條件下可與2-硝基苯肼生成衍生化產(chǎn)物，保留時間約為10.1 min，空白溶劑和藥物基質不干擾待測物的測定，方法專屬性良好。

圖3 專屬性試驗色譜圖

線性關系考察：精密移取氯乙酸貯備液，用80%乙腈溶液逐漸稀釋，制成含氯乙酸 2.5，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0 μg/mL 的溶液。取 200 μL 上述不同質量濃度的氯乙酸溶液，置10 mL容量瓶中，按衍生化步驟，取20 μL 進樣。最終氯乙酸的質量濃度為 50，100，150，200，300，400，500 ng/mL，以氯乙酸質量濃度（C，ng/mL）為橫坐標、氯乙酸衍生物峰面積（A）為縱坐標，按最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程C=54.858A+333.82，r=0.9996（n=7）。結果表明，待測物質量濃度在50～500 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取質量濃度為150 ng/mL的對照溶液，衍生化反應后重復進樣6次。結果的RSD為1.42% （n=6），表明儀器精密度良好。

定量限和檢測限確定：以信噪比（S/N）3∶1為本方法的檢測限，以信噪比（S/N）10∶1為本方法的定量限，衍生化反應后，50 ng/mL氯乙酸衍生物的信噪比為13.2，作為定量限；20 ng/mL氯乙酸衍生物的信噪比為4.1，作為檢測限。

加樣回收試驗：精密稱取他達拉非20.03mg，置10mL容量瓶中，加入500 μL衍生化試液，500 μL催化劑溶液，加80%乙腈稀釋至刻度，搖勻，精密稱取他達拉非20.11mg，分別制備低（50.28ng/mL）、中（150.82ng/mL）、高（502.75 ng/mL）質量濃度的加樣供試品溶液，每個質量濃度各3份，按2.3項下方法反應制得，另制備150.11 ng/mL氯乙酸的衍生化反應對照溶液。分別取以上溶液進樣測定，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）

穩(wěn)定性試驗：對150ng/mL氯乙酸對照溶液進行衍生化后，于室溫下放置 0，1，2，4，6，8h 時測定，以待測物峰面積（A）的變化考察待測物的穩(wěn)定性。結果的RSD為2.64%（n=6），表明氯乙酸衍生物在室溫下放置0～8 h穩(wěn)定性較好。

2.7 樣品含量測定

取他達拉非供試品20 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加入500 μL衍生化試液，500 μL催化劑溶液，加70%乙腈稀釋至刻度，搖勻，室溫反應2 h，取20 μL進樣。同法測定150 ng/mL氯乙酸對照溶液，以峰面積計算含量，結果他達拉非樣品中的氯乙酸未達檢測限。

3 討論

色譜分離時，由于2-硝基苯肼顯堿性，pH越小出峰時間越早，為使其與衍生化產(chǎn)物足夠分離，選擇了酸性較強的0.1%磷酸溶液作為水相。通過對流動相比例的優(yōu)化，進一步提高了分離度，且不影響柱效。

以氯乙酸衍生物的色譜峰面積為指標，此衍生化方法和色譜條件對其他藥物中氯乙酸殘留的測定同樣具有借鑒意義。衍生化溶劑需要完全溶解待測藥物，才能準確測定藥物中的氯乙酸殘留，有機相比例過低會影響反應效率，有機相比例過高會導致衍生化試劑的溶解度下降，進而影響衍生化效率，對于該衍生化方法的應用而言，溶劑對反應效率和回收率的影響需要重點考察。