高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地蒲黃藥材中3種黃酮苷元含量

楊棣華，梁文能

（廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405）

蒲黃為香蒲科植物水燭香蒲Typha angustifoliaL.、東方香蒲T.orientalisPresl或同屬植物的干燥花粉，通常夏季采收，篩取花粉，作為藥用［1］。臨床主要用生品蒲黃和蒲黃炭，二者作用稍有不同，生品主要用于活血化瘀，蒲黃炭主要用于外傷出血［2-3］。蒲黃的主要活性成分為黃酮苷及苷元［4-5］。2015 年版《中國藥典（一部）》中采用薄層色譜和液相色譜對其苷元香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷進行測定［1］。黃酮苷和苷元在藥理中都具有活性，黃酮苷類化合物也具有活血化瘀作用［6-7］。目前，對于黃酮苷類的測定方法主要有紫外光譜法［8-9］、毛細管電泳法［10］、高效液相色譜法［11-12］等，本研究中根據(jù)黃酮苷的化學性質(zhì)并參考文獻［13］建立高效液相色譜法，測定不同產(chǎn)地蒲黃中3種黃酮苷元的含量并比較其差異，為優(yōu)化蒲黃的質(zhì)量和臨床使用提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ulitimate3000型高效液相色譜儀，包括四元洗脫泵，DAD檢測器和變色龍工作站（美國賽默飛世爾儀器公司）；BSA-124S型電子天平（十萬分之一，德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥

槲皮素對照品（批號為100081-201408，質(zhì)量分數(shù)為 99.1%），山柰素對照品（批號為 110861-201310，質(zhì)量分數(shù)為93.2%），異鼠李素對照品（批號為110860-201109，質(zhì)量分數(shù)為99.0%），均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；水為超純水（美國Milli-Q公司）；磷酸（分析純，國藥試劑化學有限公司）；蒲黃藥材分別來源于江蘇、內(nèi)蒙古、陜西、安徽、寧夏、湖北、四川、廣西8個不同產(chǎn)地的12批藥材（見表1），經(jīng)我院梁文能副主任藥師鑒定為香蒲科植物水燭香蒲Typha angustifoliaL.的干燥花粉，均符合藥典要求。

表1 不同產(chǎn)地蒲黃藥材樣品

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Hypersil BDS-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -0.4% 磷酸溶液（50 ∶50，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：360 nm；進樣量：10 μL。在此色譜條件下，理論板數(shù)按槲皮素峰計不低于 3690，拖尾因子為 0.95 ～1.05，各色譜峰分離度均大于1.5。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

取置五氧化二磷干燥12 h以上的槲皮素10.12 mg，精密稱定，置 25 mL容量瓶中，山柰素 5.82 mg置25 mL容量瓶中，異鼠李素6.05 mg置50 mL容量瓶中，加甲醇分別稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。分別精密吸取上述槲皮素對照品貯備液1 mL、山柰素對照品貯備液1 mL和異鼠李素對照品貯備液5 mL，置同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品混合溶液（每1 mL含槲皮素40.48 μg、山柰素23.28 μg、異鼠李素 60.50 μg）。取浙江湖州產(chǎn)的蒲黃藥材粉碎，過4號篩，取粉末1.0 g，精密稱定，精密加入甲醇 -25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）的混合溶液 25 mL，加熱回流提取1 h，迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察：精密吸取對照品混合溶液1，2，5，10，25 μL，分別注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進樣測定，以進樣量（X，ng）為橫坐標、相對應的峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表2。

表2 方法學考察結果

精密度試驗：取對照品混合溶液，按擬訂色譜條件進樣10 μL，重復6次，記錄峰面積。結果見表2，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品（批號為180501）溶液，按擬訂色譜條件分別于 0，1，2，4，8，12，24 h 時進樣測定，進樣量為10 μL，記錄色譜峰面積。結果見表2，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：取同一批蒲黃藥材（批號為180501），依法制備供試品溶液，平行6份，按擬訂色譜條件進樣測定。結果見表2，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密稱取已知含量的蒲黃藥材（批號為 180501）粉末 0.50 g，平行制備 6份供試品；分別精密吸取槲皮素貯備液3 mL，置10 mL容量瓶中（每1 mL含槲皮素0.1214 mg）作為待加溶液，分別精密量取上述槲皮素待加對照品溶液1 mL，山柰素對照品貯備液1 mL，異鼠李素對照品貯備溶液3 mL，加入6份供試品中，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，分別計算回收率。結果見表3。

2.4 樣品含量測定

取上述不同產(chǎn)地的樣品，依法制備供試品溶液并測定，用標準曲線法計算含量（以干燥品計）。結果見表4。

3 討論

按《中國藥典（一部）》蒲黃含量測定的取樣量進行考察，分別取樣 0.5，1.0，2.0 g。當取樣量少時，色譜峰面積較小，基線噪音干擾較大；取樣量太大，則對照品稱樣需要增大，易造成對照品浪費。故選擇1.0 g作為取樣量。參照銀杏葉中3種黃酮苷的測定方法對供試品溶液的制備方法進行考察，考察了鹽酸的不同比例（甲醇-10%鹽酸溶液、甲醇-25%鹽酸溶液、甲醇-35%鹽酸溶液）、不同提取方式（超聲、回流、索氏提取）、不同提取時間（30，60，90 min）。結果發(fā)現(xiàn)，甲醇和鹽酸的用量對3種黃酮苷元的含量影響很大。鹽酸濃度低，水解不完全，提取率低；鹽酸濃度大，對液相色譜的管路有腐蝕作用，同時酸濃度過大對色譜柱的要求較高，影響其適用性。綜合考慮，采用25%鹽酸溶液進行水解，同時對甲醇 -25%鹽酸溶液不同體積比（1 ∶1，2 ∶1，4 ∶1，8 ∶1，10 ∶1，V/V）進行考察，結果甲醇 -25%鹽酸溶液（4 ∶1，V/V）提取效率最高，回流和索氏提取效率基本一致，均高于超聲，由于回流方法簡單，故采用回流提取。提取時間在60 min以后含量基本不變，故采用提取時間為60 min，綜合考慮選擇甲醇 -25%鹽酸溶液（4 ∶1，V/V），回流提取60 min作為供試品溶液的制備方法。

表33種黃酮苷元的加樣回收結果（n=6）

表4 不同產(chǎn)地蒲黃藥材中3種黃酮苷含量測定結果（mg/g，n=2）

參考2015年版《中國藥典（一部）》銀杏葉藥材及其制劑［13］項下含量測定條件，對色譜條件中的流動相和檢測波長進行了考察，采用DAD檢測器在200～400 nm波長內(nèi)進行全波長掃描，分別結合槲皮素、山柰素和異鼠李素3種對照品的光譜圖進行比較，最后選擇檢測波長為360 nm。考察流動相的組分，分別以甲醇-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液、乙腈-水和甲醇-水作為流動相，結果發(fā)現(xiàn)以甲醇-水和乙腈-水作為流動相時，異鼠李素的峰均有拖尾現(xiàn)象，對稱因子較低，而采用甲醇-0.4%磷酸溶液為流動相時，供試品中3種成分的色譜法峰形良好，基線平穩(wěn)，對稱因子為0.95～1.05內(nèi)，理論板數(shù)高，陰性對照無干擾。故確定甲醇-0.4%磷酸溶液為流動相，檢測波長為360 nm，與《中國藥典（一部）》中銀杏葉項下色譜條件一致。

本研究結果顯示，不同產(chǎn)地的蒲黃藥材中3種黃酮苷的含量差異較大，廣西桂林產(chǎn)的蒲黃藥材中3種黃酮苷類成分含量最高，槲皮素為0.3721 mg/g，山柰素為0.4173 mg/g，異鼠李素為 1.7028 mg/g，這可能與當?shù)貧夂蚝蜕L環(huán)境有關。蒲黃多生長在沼澤湖泊周圍等水量充足的地方，寧夏固原產(chǎn)和內(nèi)蒙古包頭產(chǎn)的蒲黃藥材中3種黃酮苷元成分含量最低，可能與當?shù)亟涤炅可儆嘘P?？梢?，不同產(chǎn)地蒲黃藥材中3種黃酮苷類成分差異較大，故建議增加黃酮苷類化合物作為蒲黃藥材的質(zhì)控指標。不同產(chǎn)地蒲黃藥材對其臨床使用具有一定影響，臨床使用蒲黃藥材應多采購廣西、江蘇、湖北等地的，可保證藥效的最大限度發(fā)揮，同時為開發(fā)和利用蒲黃藥材的藥用價值提供參考。