二丁顆粒對急性痛風性關節(jié)炎大鼠的抗炎作用

李天旺，田 鵬，趙 力，姚會欣，陳金強

（中國人民解放軍第252醫(yī)院，河北 保定 071000）

痛風性關節(jié)炎是40歲以上男性常見炎癥性關節(jié)疾病，是尿酸單鈉分解引起的關節(jié)疾病，伴有嘌呤代謝紊亂［1］。痛風的進展一般分為3個階段：無癥狀的高尿酸血癥、無癥狀的間歇性痛風發(fā)作和無緩解的長期慢性痛風［2］。急性痛風性關節(jié)炎（AGA）是由于尿酸鹽結晶沉著于關節(jié)及周圍組織而引起的急性特征性炎性反應［3］，具體作用機制目前尚不完全清楚。雖然痛風患者可能首先抱怨疼痛，但有效治療應考慮其潛在炎癥。目前，非甾體抗炎藥（NSAIDs）是痛風的主要治療藥物，用于鎮(zhèn)痛和抑制炎癥［4］。其中，吲哚美辛是治療AGA的標準藥物，但不良反應多，以胃腸道尤其顯著［5］。二丁顆粒為藥典成方制劑，具有清熱解毒功效［6］，可用于炎癥性疾病的治療。本研究中探討了二丁顆粒對AGA大鼠抗炎消腫止痛的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：HBS-1096B型酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）；TP1020型組織脫水機、EG1160型包埋機、RM2255型全自動輪轉切片機等病理配套設備，均購于德國Leica公司；ML203E型電子天平（上海梅特勒公司）；GL-10000C型高速冷凍離心機（上海醫(yī)學儀器廠）；DSX100型光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

試藥：二丁顆粒（四川大千藥業(yè)公司，批號為140101）；尿酸鈉（美國Sigma公司）；酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.2 造模

動物及分組：取健康3個月齡雄性SPF級SD大鼠60只，體質量220～260 g，由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，許可證號為SCXK（湘）2009-0004。實驗動物相關處置均符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》要求。按隨機數(shù)字表法均分為假手術組、模型組、吲哚美辛組和二丁顆粒低、中、高劑量組，各10只。

大鼠急性痛風性關炎模型制備：各組大鼠仰臥固定，剔除右后肢小腿關節(jié)毛，消毒，麻醉后用6號注射針以大鼠右深關節(jié)外側后方為穿刺點，距小腿關節(jié)背后從45°方向插入至脛骨肌腱內側，注入3.0%尿酸鈉溶液200 μL，假手術組給予等量無菌生理鹽水。

干預：適應性喂養(yǎng)1周后開始給藥，吲哚美辛組灌胃給予3.0 mg/kg吲哚美辛，二丁顆粒低、中、高劑量組分別給予灌胃質量濃度為10，20，40 mg/kg的二丁顆粒，假手術組和模型組給予等量生理鹽水，持續(xù)給予7 d，在第5天給藥后1 h進行造模。

1.3 指標測定

關節(jié)腫脹程度：于造模前1 h和造模后48 h，用周長法測右后肢小腿關節(jié)同一部位周徑，計算腫脹度=致炎后小腿關節(jié)周徑-致炎前小腿關節(jié)周徑。大鼠關節(jié)炎癥指數(shù)觀察：根據(jù)Coderre炎癥指數(shù)分級評定標準在造模后48 h分別觀察大鼠炎癥指數(shù)。炎癥指數(shù)評分標準為正常（0分）；關節(jié)輕度腫脹、皮膚紅斑、骨性標志可見（1分）；關節(jié)明顯紅腫，但局限于關節(jié)部位，骨性標志消失（2分）；關節(jié)以外肢體腫脹（3分）。

炎癥指標：ELISA法檢測關節(jié)軟骨組織白細胞介素 1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）和環(huán)氧合酶-2（COX-2）含量，于末次給藥1 h后處死大鼠，每組8只大鼠用1 mL生理鹽水灌洗關節(jié)腔后收集關節(jié)液，取少量關節(jié)囊和滑膜組織制成勻漿，按ELISA試劑盒說明書測定各指標含量。組織形態(tài)學觀察：處死大鼠，每組2只大鼠對膝關節(jié)進行固定、脫鈣、脫水、包埋、切片、HE染片后封片，觀察膝關節(jié)病理改變情況。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件。計量資料以表示，分析前行正態(tài)性檢驗，采用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 關節(jié)腫脹程度及炎癥評分

各組較假手術組大鼠關節(jié)出現(xiàn)不同程度腫脹（P＜0.05），炎癥評分明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，吲哚美辛組和二丁顆粒劑量組大鼠關節(jié)腫脹度及炎癥評分均明顯降低（P＜0.05）；二丁顆粒劑量組較吲哚美辛組大鼠關節(jié)腫脹度及炎癥評分有一定增加，隨著二丁顆粒劑量的增加而均明顯降低。詳見表1。

表1 各組大鼠關節(jié)腫脹程度及炎癥評分比較（± s，n=10）

表1 各組大鼠關節(jié)腫脹程度及炎癥評分比較（± s，n=10）

注：與假手術組相比，#P ＜0.05；與模型組相比，*P ＜0.05；與吲哚美辛組相比，△P＜0.05。下表同。

組別假手術組模型組吲哚美辛組二丁顆粒 低劑量組中劑量組高劑量組關節(jié)腫脹程度（mm）4.05 ± 5.3267.49 ± 8.05#11.40 ± 1.04#*45.45 ± 6.05#*△32.43 ± 2.02#*△17.52 ± 2.03#*炎癥評分（分）05.22 ±0.81#3.25 ±0.34#*4.57 ±0.38#*△3.69 ±0.99#*△3.31 ±0.44#*

2.2 關節(jié)軟組織中炎癥指標

各組較假手術組大鼠關節(jié)軟組織中IL-1β，TNF-α，COX-2含量均明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，吲哚美辛組和二丁顆粒劑量組大鼠關節(jié)軟組織中各指標含量均明顯降低（P＜0.05）；二丁顆粒低、中劑量組較吲哚美辛組大鼠關節(jié)軟組織中各指標含量有一定增加，隨著二丁顆粒劑量的增加而明顯降低（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠關節(jié)軟組織中炎癥指標比較（± s，ng/L，n=8）

表2 各組大鼠關節(jié)軟組織中炎癥指標比較（± s，ng/L，n=8）

組別假手術組模型組吲哚美辛組二丁顆粒低劑量組中劑量組高劑量組IL-1β 19.24 ±2.9456.05 ±4.57#22.59 ±3.68#*45.24 ±5.93#*△35.00 ±4.61#*△24.59 ±4.38#*TNF-α 27.64 ± 2.1772.21 ± 4.81#39.54 ± 2.50#*60.57 ± 4.38#*△48.69 ± 2.99#*△41.73 ± 5.94#*COX-210.54 ± 1.5789.18 ± 8.1152.39 ± 4.35#*67.23 ± 4.18#*△59.30 ± 4.90#*△54.31 ± 7.61#*

2.3 病理組織形態(tài)學觀察

假手術組：關節(jié)軟骨表面光滑，關節(jié)腔無滲出，滑膜細胞排列整齊；模型組：滑膜細胞增生，伴炎性細胞浸潤，小血管增生和成纖維細胞增多；吲哚美辛組：關節(jié)軟骨光滑，關節(jié)腔內見少量滲出物，滑膜細胞排列較整齊，見少許炎性細胞浸潤；二丁顆粒組在炎癥、變性、壞死方面均較模型組輕，隨著二丁顆粒劑量的增加，癥狀有一定緩解。詳見圖1。

圖1 各組大鼠病理組織形態(tài)學觀察（HE，×400）

3 討論

痛風屬中醫(yī)“痹癥”范疇，病因為氣血運行不暢、邪滯經(jīng)絡和濕熱內蘊，因此治療痛風常以通絡止痛和清熱利濕為主［7］。二丁顆粒由板藍根、半邊蓮、紫花地丁、蒲公英組方，其中板藍根具有清熱解毒功效，半邊蓮、紫花地丁、蒲公英具有利濕、消腫、利尿散結功效［8］。本研究結果顯示，二丁顆粒具有消腫、抗炎功能，其效果與吲哚美辛相當。

AGA以關節(jié)滑膜急性炎癥為特征，很可能有多種病因和各種病理途徑。炎癥過程被認為是由巨噬細胞驅動的，巨噬細胞產(chǎn)生亞標準數(shù)量的促炎細胞因子，這是炎性反應的中心介質［9］。在正常的局部炎性反應中，促炎細胞因子的產(chǎn)生受到嚴格控制。但在AGA等情況下導致促炎細胞因子的濃度升高。研究表明，多種炎性因子參與了關節(jié)炎的發(fā)作，IL-1β是調節(jié)炎癥的始動因素和炎性反應的重要介質，參與了急性和慢性痛風性關節(jié)炎的發(fā)展過程［10］。TNF-α是炎性后最早出現(xiàn)的細胞因子，主要由巨噬細胞和淋巴細胞產(chǎn)生，其過度表達時介導炎性因子趨化作用而加劇瀑布樣炎性反應，最終導致組織損傷。通過減少或拮抗TNF-α的產(chǎn)生可改善炎癥對大鼠造成的損傷［11］。選擇性COX-2抑制劑是為了應對較少不良反應的非甾體抗炎藥需求而開發(fā)，主要抑制COX-2酶。COX-2酶催化前列腺素的合成，參與炎性反應。COX蛋白存在于 2種亞型（COX-1和COX-2），每種亞型在不同的細胞類型中都有不同的表達模式。COX-1已被建議用作為正常血小板、胃和腎功能提供前列腺素（PG）的生理水平，相反，COX-2被發(fā)現(xiàn)在動物炎癥部位和炎癥性疾病中高度誘導，因此，選擇性COX-2抑制劑的鎮(zhèn)痛和抗炎作用與非選擇性非甾體抗炎藥相似，但對胃腸道的不良作用大大降低［12］。本研究結果顯示，二丁顆?？蓽p低大鼠關節(jié)軟組織中IL-1β，TNF-α，COX-2含量，提示在減輕炎性反應的同時，還能一定程度上減輕藥品不良反應。

綜上所述，二丁顆粒對AGA具有良好的防治作用，其作用可能與抑制炎性因子IL-1β和TNF-α水平有關，同時還抑制COX-2。