尿激酶治療大鼠急性深靜脈血栓的實(shí)驗(yàn)研究

馬建華 汪坤 李鑫

深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）是臨床上常見、多發(fā)的靜脈疾病，發(fā)病率達(dá)100/10萬(wàn)[1]，DVT并發(fā)癥包括肺栓塞、血栓后綜合征、靜脈性壞疽，對(duì)患者健康及生活質(zhì)量有很大影響。因此，如何采用更為有效的治療方法促進(jìn)血栓再通成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。尿激酶亦稱為尿激酶型纖溶酶原激活物，能催化裂解纖溶酶原成纖溶酶，降解纖維蛋白凝塊和纖維蛋白原、凝血因子Ⅴ和凝血因子Ⅷ等，從而發(fā)揮溶栓作用[2]。由于其價(jià)廉、高效、出血并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)，是主要的溶栓藥物，溶栓效果已得到肯定，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究通過(guò)建立大鼠下腔靜脈血栓模型，觀察尿激酶對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、新生毛細(xì)血管、VEGF表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠20只，雄性，體質(zhì)量250～280g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，均遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理辦法，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理驗(yàn)證。

1.1.2 主要試劑及儀器 兔抗血管性血友病因子（vWF）、兔抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），TUNEL（瑞士Roche公司）；石蠟切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司），共聚焦顯微鏡（德國(guó)萊卡公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血栓模型的制備 36g/L水合氯醛（1ml/100g）麻醉大鼠，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，嚴(yán)格無(wú)菌操作。游離左腎靜脈與下腔靜脈匯合處和髂總靜脈分叉處之間的下腔靜脈段。分別在左腎靜脈匯合下腔靜脈處下方、髂總靜脈分叉處上方用顯微血管夾暫時(shí)阻斷下腔靜脈2h，經(jīng)25G細(xì)針穿刺無(wú)血液流出，確認(rèn)血栓形成（血管由紅色變?yōu)榘导t色）后取下血管夾關(guān)腹[3]。

1.2.2 給藥 術(shù)后1d尿激酶組給予尾靜脈注入尿激酶 20 000U/kg，每天 1次，共 10d；PBS組給予相同容量的PBS，每天1次，共10d。

1.2.3 取材 術(shù)后14d將兩組SD大鼠麻醉后進(jìn)腹，取出2.0cm病變段下腔靜脈，用生理鹽水漂洗，放入10%甲醛溶液中固定，脫水后包埋，包埋好的標(biāo)本用石蠟切片機(jī)切片，厚度為5μm，并將蠟片貼附于多聚賴氨酸處理過(guò)的載玻片上。

1.2.4 HE染色 將切片用二甲苯進(jìn)行去蠟處理兩次；用無(wú)水乙醇進(jìn)行清洗；進(jìn)行4min左右的蘇木紫染色后水洗，待細(xì)胞核染成藍(lán)色后停止水洗過(guò)程；用伊紅、95%乙醇以及無(wú)水乙醇進(jìn)行兩次染色；最后用苯酚二甲苯與二甲苯進(jìn)行處理；中性樹膠封固。

1.2.5 組織免疫熒光 將切片置于60℃烘箱烘4h。二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，切片置于0.1mol/L pH為6.0的枸櫞酸液修復(fù)液中，微波煮沸10～20min進(jìn)行抗原修復(fù)，室溫下冷卻20min，3%H2O2溶液處理10min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，用PBS洗5min×3次，滴加血清封閉，濕盒中37℃封閉30min。傾去血清，4℃過(guò)夜孵育一抗（vWF、VEGF），PBS洗 3次。滴加二抗于濕盒中37℃避光孵育2h，滴加DAPI避光孵育2min，封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 凋亡染色采用In Situ Cell Death Detection Kit（Roche公司）凋亡試劑盒，按照說(shuō)明書對(duì)病變段下腔靜脈切片進(jìn)行TUNEL染色，檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。每組隨機(jī)選取5個(gè)視野，光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠靜脈壁血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)比較尿激酶組血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)明顯多于PBS組（P＜0.05），見圖1、表1。

圖1 兩組靜脈壁內(nèi)皮細(xì)胞（×200）

2.2 兩組大鼠受累血管新生毛細(xì)血管、VEGF表達(dá)、細(xì)胞凋亡比較尿激酶組和PBS組相比，新生毛細(xì)血管數(shù)、VEGF表達(dá)、細(xì)胞凋亡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2～4、表1。

圖2 兩組新生毛細(xì)血管vWF染色（×200）

圖3 兩組VEGF表達(dá)（×200）

圖4 兩組細(xì)胞凋亡TUNEL染色（×200）

表1 兩組血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)、新生毛細(xì)血管數(shù)、VEGF表達(dá)、細(xì)胞凋亡比較（±s，個(gè)/視野）

表1 兩組血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)、新生毛細(xì)血管數(shù)、VEGF表達(dá)、細(xì)胞凋亡比較（±s，個(gè)/視野）

組別 血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)新生毛細(xì)血管數(shù) VEGF表達(dá) 細(xì)胞凋亡PBS 組 12.46±0.52 18.68±0.63 10.56±0.49 37.17±0.32尿激酶組 38.35±0.78 42.15±0.35 35.46±0.56 11.26±0.43 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

DVT是周圍血管系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病之一，主要機(jī)制為靜脈淤滯、血管壁損傷以及高凝狀態(tài)[4]。手術(shù)、外傷是下肢深靜脈血栓最常見及最重要的病因。目前國(guó)內(nèi)外深靜脈血栓的非手術(shù)治療主要是抗凝、溶栓、祛聚等措施。尿激酶作為臨床上應(yīng)用最為廣泛的溶栓制劑，治療深靜脈血栓形成已有數(shù)十年的歷史[5]。

血栓的機(jī)化和再通是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，是由多種細(xì)胞因子和細(xì)胞參與的動(dòng)態(tài)的、協(xié)調(diào)的過(guò)程，包括炎細(xì)胞的浸潤(rùn)、新生血管形成和再內(nèi)皮化，盡管已有大量的基礎(chǔ)及臨床研究，但具體的機(jī)制仍不清楚[6，7]。近年研究發(fā)現(xiàn)尿激酶在血栓機(jī)化再通過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[8，9]。本研究采用尾靜脈推注尿激酶造成血管局部病變部位的高纖溶環(huán)境，促使血栓更加快速有效的溶解，恢復(fù)病變血管再通，取得了滿意療效，提示尿激酶能夠增加深靜脈血栓大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞、新生毛細(xì)血管數(shù)，促進(jìn)VEGF表達(dá)，且能明顯抑制其細(xì)胞凋亡。血管內(nèi)皮細(xì)胞、新生毛細(xì)血管、VEGF和細(xì)胞凋亡在尿激酶促進(jìn)血栓機(jī)化和再通中的相互關(guān)系尚不明確。

尿激酶可激活纖溶酶原活化為纖溶酶，使纖維蛋白原降解而發(fā)揮溶栓作用。血管內(nèi)皮受損、血流緩慢和血液高凝狀態(tài)是導(dǎo)致深靜脈血栓形成的三大因素[10，11]，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，內(nèi)皮下膠原纖維暴露，與血小板膜相互作用使得血小板活化而形成血栓，可見血管內(nèi)皮細(xì)胞在血栓形成機(jī)制中處于關(guān)鍵的中心地位。血管新生是指通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂增殖，在已有血管上以出芽方式長(zhǎng)出新生的血管[12]。血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)裂隙浸入血栓內(nèi)逐漸形成新的血管腔和小靜脈，而使血栓部分再通，隨著血栓進(jìn)一步溶解，裂隙進(jìn)一步擴(kuò)大，最后恢復(fù)血栓形成前的狀態(tài)，血栓完全再通。研究發(fā)現(xiàn)，尿激酶有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)管腔再通的作用[13]；尿激酶還可減輕血栓引起的血管壁急性炎癥反應(yīng)，從而減少血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和膠原沉積，促進(jìn)血管重塑[13]。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的特異性直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的最重要血管生長(zhǎng)因子之一，具有誘導(dǎo)新生血管生成的作用[14，15]；VEGF在血管發(fā)生/新生與重塑中起著中心調(diào)節(jié)作用，它能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，分化成熟，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而且能刺激血管新生中的重要環(huán)節(jié)，增加血管內(nèi)皮的通透性，形成血管生成的臨時(shí)基質(zhì)，從而使新毛細(xì)血管生成和功能成熟[16]。尿激酶可使血栓內(nèi)VEGF局部濃度增高，募集更多血管內(nèi)皮細(xì)胞到達(dá)血栓區(qū)形成新生血管。VEGF還能夠增加纖維蛋白溶解酶、尿激酶和組織型纖溶酶原的表達(dá)和活性，這些酶可以激活纖溶酶原為纖溶酶，從而促進(jìn)血栓的溶解[17]?，F(xiàn)已證實(shí)，細(xì)胞凋亡與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，深靜脈血栓形成可誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[18]，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷除以壞死形式出現(xiàn)外，還可發(fā)生凋亡，血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡也可誘發(fā)靜脈血栓形成[19]；尿激酶在血栓栓塞性疾病中可明顯抑制細(xì)胞凋亡[20]，從而發(fā)揮溶栓作用。

綜上所述，尿激酶可通過(guò)增加血管內(nèi)皮細(xì)胞、新生毛細(xì)血管、促進(jìn)VEGF表達(dá)和抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)血栓的機(jī)化和再通，為DVT的臨床治療提供更有力的參考依據(jù)。雖然尿激酶溶栓治療DVT取得了很多成果，但不同的給藥方式及劑量都會(huì)影響治療效果，而出血是溶栓治療中常見的并發(fā)癥，因此安全地、更好地發(fā)揮尿激酶的作用是需要進(jìn)一步研究的課題。