成人急性B淋巴細(xì)胞白血病微小RNA和轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)分析

蔣莉 蔡安季 文錦麗 李寧 戴勇

急性 B 淋巴細(xì)胞白血?。˙-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）是由原始B淋巴細(xì)胞在骨髓、外周血或髓外組織克隆性異常增生所導(dǎo)致的一種急性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，好發(fā)于2～5歲的兒童，在兒童以及成人的急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）中分別占85%以及75%，是最常見(jiàn)的一種ALL亞型[1，2]。近年來(lái)隨著對(duì)B-ALL發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)了一些有價(jià)值的診斷標(biāo)志物和治療的分子靶點(diǎn)，同時(shí)也提出了一些更有針對(duì)性的治療方案且取得了一定的效果。但對(duì)于成人B-ALL患者，包括化療、自體外周血干細(xì)胞移植等多種方法都不能提高總體的療效，治療后復(fù)發(fā)頻繁發(fā)生；復(fù)發(fā)患者多在6個(gè)月內(nèi)死亡，其5年生存率僅為7%[3]。因此，迫切需要對(duì)成人B-ALL的致病機(jī)理進(jìn)行研究，以尋找新的分子靶點(diǎn)和治療方法。

在人類白血病中，多種細(xì)胞遺傳學(xué)缺陷均可引起轉(zhuǎn)錄因子的異常[4，5]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA（microRNA，微小RNA）參與的基因表達(dá)調(diào)控在白血病的發(fā)生、發(fā)展中具有十分重要的作用[6]。miRNA與轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor，TF）常通過(guò)兩者之間的相互作用更精確地調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，這是哺乳動(dòng)物體內(nèi)一種重要的基因調(diào)控模式。因此，以miRNA與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作為切入點(diǎn)，從系統(tǒng)水平上研究B-ALL的發(fā)病機(jī)制具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 15例成人B-ALL患者以及10例非惡性血液病對(duì)照者的骨髓標(biāo)本均采集自廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液科的住院患者。成人B-ALL患者，男7例，女8例，年齡18～71歲，平均36.5歲；全部患者均為初發(fā)病例，在采樣前均未接受化療或放療，且均符合B-ALL的診斷標(biāo)準(zhǔn)。非惡性血液病對(duì)照者為骨髓象正常的發(fā)熱或貧血原因待查的患者，其中男6例，女4例，年齡10～73歲，平均39.0歲。本研究經(jīng)廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，并征得所有患者的知情同意。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 組織核蛋白抽提試劑盒、Spin column separation system 試劑盒、TranSignalTMProtein/DNA 轉(zhuǎn)錄因子芯片（美國(guó)Panomics公司）；SuperscriptTMⅢ反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen 公司）；2×SYBR Green PCR 混合液（Applied Biosystems公司）。

1.2 方法

1.2.1 Illumina測(cè)序 參照我們以前的方法應(yīng)用Illumina HiSeq 2000 測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行高通量 miRNA測(cè)序[7]。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄因子芯片檢測(cè) 采用美國(guó)TranSignalTMProtein/DNA轉(zhuǎn)錄因子芯片進(jìn)行芯片的雜交與檢測(cè)。按照組織核蛋白抽提試劑盒說(shuō)明抽提組織核蛋白，Bradford法檢測(cè)蛋白濃度。25μg的組織核蛋白抽提物與生物素標(biāo)記的DNA探針混勻，15℃孵育30min，得到核蛋白/DNA探針復(fù)合物。該復(fù)合物經(jīng)20g/L瓊脂糖凝膠在0.5×TBE電泳緩沖液中120V電泳20min，回收并純化核蛋白/DNA探針復(fù)合物；然后按照 Spin column separation system 試劑盒說(shuō)明書洗脫、分離出游離的探針。洗脫下來(lái)的探針95℃變性3min后迅速放置在冰上2min，隨后置入雜交瓶里與芯片膜42℃雜交24h。1×封閉緩沖液室溫封閉芯片膜15min，加入HRP偶聯(lián)鏈酶素親和素抗體（1∶500），室溫孵育 15min，顯影，X 光片曝光。X光片上的圖像經(jīng)ImageScanner掃描和ScanAlyze軟件處理，獲得芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)組信號(hào)強(qiáng)度/對(duì)照組信號(hào)強(qiáng)度的比值≥2.0或≤0.5均判定差異有意義。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量 PCR（q-PCR）使用 Oligo（dT）作為反轉(zhuǎn)錄引物，參照SuperscriptTMⅢ反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書進(jìn)行cDNA的合成。以18S rRNA作為內(nèi)參照，根據(jù) 2×SYBR Green PCR 混合液說(shuō)明書，在 ABI Prism? 7500型熒光定量PCR儀上進(jìn)行q-PCR反應(yīng)。q-PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)反應(yīng)10min；然后95℃變性10s，60℃退火和延伸60s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。用2-△△Ct法計(jì)算miRNA的差異表達(dá)比值。

1.2.4 miRNA和轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)關(guān)聯(lián)分析

1.2.4.1 差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測(cè) 應(yīng)用miRanda、TargetScan、PicTar以及miRTarBase四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇miRNA測(cè)序中差異表達(dá)倍數(shù)≥2的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。其中，轉(zhuǎn)錄因子也作為基因參與miRNA的靶基因預(yù)測(cè)。為了提高靶基因預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，將 miRanda、TargetScan、PicTar三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中任意兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到的靶基因與miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的靶基因取并集獲得候選的miRNA及其靶基因。

1.2.4.2 獲取與B-ALL相關(guān)的miRNA-靶基因配對(duì)以及miRNA-靶轉(zhuǎn)錄因子配對(duì) 為了減少冗余，將上述候選的miRNA靶基因與MalaCards數(shù)據(jù)庫(kù)中B-ALL相關(guān)的基因和轉(zhuǎn)錄因子取交集，獲取與B-ALL相關(guān)的miRNA-靶基因配對(duì)以及miRNA-靶轉(zhuǎn)錄因子配對(duì)。

1.2.4.3 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè) 提取miRNA-靶基因配對(duì)以及miRNA-靶轉(zhuǎn)錄因子配對(duì)中的相應(yīng)miRNA以及靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)。取基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游5 000 bp到下游1 000 bp區(qū)域，應(yīng)用UCSC Genome Browser中的TFBS Conserved Track數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)。

1.2.4.4 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄因子芯片檢測(cè)中差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的合并 為了提高轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，將生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄因子芯片檢測(cè)中差異表達(dá)倍數(shù)≥2的轉(zhuǎn)錄因子取交集，然后提取相應(yīng)的miRNA以及靶基因獲得與B-ALL相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子-miRNA配對(duì)以及轉(zhuǎn)錄因子-靶基因配對(duì)。

1.2.4.5 構(gòu)建miRNA-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)分析 合并轉(zhuǎn)錄因子-miRNA配對(duì)、轉(zhuǎn)錄因子-靶基因配對(duì)、miRNA-靶基因配對(duì)以及miRNA-靶轉(zhuǎn)錄因子配對(duì)，構(gòu)建miRNA-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并利用Gephi軟件繪制調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。在miRNA-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中查找前饋環(huán)與反饋環(huán)調(diào)控模塊，并選擇連通度≥10的節(jié)點(diǎn)作為中心節(jié)點(diǎn)，鑒定出相應(yīng)的核心調(diào)控因子。利用基因功能注釋工具GO（Gene Ontology，基因本體論）數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行GO分析和Pathway分析，查找與B-ALL相關(guān)的信號(hào)通路以及基因功能分類。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)分析兩組樣本共檢測(cè)出201個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其中57個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在B-ALL組呈表達(dá)上調(diào)，144個(gè)轉(zhuǎn)錄因子呈表達(dá)下調(diào)；在芯片檢測(cè)結(jié)果中，我們選擇4個(gè)表達(dá)上調(diào)以及4個(gè)表達(dá)下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子，應(yīng)用q-PCR技術(shù)驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄因子芯片結(jié)果的可靠性，其檢測(cè)結(jié)果的變化趨勢(shì)一致。

2.2 構(gòu)建miRNA-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)通過(guò)合并miRNA-靶基因、miRNA-靶轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄因子-miRNA以及轉(zhuǎn)錄因子-靶基因4種配對(duì)關(guān)系見(jiàn)表1，我們構(gòu)建了成人B-ALL的miRNA-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖1）。

表1 B-ALL的miRNA-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)配對(duì)關(guān)系總結(jié)

圖1 成人急性B淋巴細(xì)胞白血病的miRNA-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.3 網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模塊分析以及核心調(diào)控因子的鑒定

我們從調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中共鑒定出526個(gè)前饋環(huán)（feedforward loop，F(xiàn)FL）以及 9 個(gè)反饋環(huán)（feedback loop，F(xiàn)BL）調(diào)控模塊，見(jiàn)表2。此外，我們選擇連通度≥10的節(jié)點(diǎn)作為中心節(jié)點(diǎn)，在網(wǎng)絡(luò)中鑒定出47個(gè)核心調(diào)控因子，包括28個(gè)核心miRNA如miR-17-5p、miR-181b-5p、miR-29b-3p、miR-29c-3p、miR-20a-5p等；19個(gè)核心轉(zhuǎn)錄因子如CREB1、MYC、FOXO4、NFKB1、MEF2A 等。

表2 B-ALL的miRNA-轉(zhuǎn)錄因子-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中前饋環(huán)與反饋環(huán)調(diào)控模塊相關(guān)性總結(jié)

2.4 網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的GO分析和Pathway分析如表2所示，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的GO分析表明，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)主要參與了基因表達(dá)的正性調(diào)控、大分子代謝過(guò)程的正性調(diào)控、造血或淋巴樣器官發(fā)育等10個(gè)生物學(xué)過(guò)程。Pathway分析表明，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)主要富集在癌癥信號(hào)通路、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)信號(hào)通路以及慢性髓性白血病信號(hào)通路等25個(gè)信號(hào)通路。其中，PI3K-Akt信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路以及細(xì)胞周期信號(hào)通路為目前已知的與B-ALL發(fā)病相關(guān)的信號(hào)通路。

3 討論

急性B淋巴細(xì)胞白血病是一種遺傳異質(zhì)性和復(fù)雜性疾病，多種不同類型的細(xì)胞遺傳學(xué)異常以及分子遺傳學(xué)突變?cè)贐-ALL發(fā)病機(jī)制中起重要作用[8，9]。但這些遺傳學(xué)上的變異無(wú)法完全解釋其生物學(xué)特征以及遺傳異質(zhì)性[9]。目前，B-ALL的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。尤其，遺傳的異質(zhì)性和復(fù)雜性限制了其發(fā)病機(jī)制中起主導(dǎo)作用的核心調(diào)控因子與核心調(diào)控模塊的發(fā)現(xiàn)。因此，迫切需要對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。基于高通量的表達(dá)譜檢測(cè)技術(shù)以及生物信息學(xué)分析方法，系統(tǒng)生物學(xué)致力于在網(wǎng)絡(luò)水平探討生物分子的相互作用，有助于發(fā)現(xiàn)新的核心調(diào)控因子、調(diào)控模塊及其相關(guān)的信號(hào)通路，并在整體水平揭示疾病發(fā)生的分子機(jī)制[10，11]。因此，應(yīng)用系統(tǒng)生物學(xué)方法研究B-ALL的發(fā)病機(jī)制具有一定的必要性。

作為一種具有基因表達(dá)調(diào)控功能的內(nèi)源性小片段單鏈RNA，miRNA與轉(zhuǎn)錄因子關(guān)系密切。轉(zhuǎn)錄因子較一般基因更有可能成為miRNA調(diào)控的靶標(biāo)，其作為潛在靶標(biāo)的概率較一般基因高出2倍左右[12，13]。miRNA可通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子mRNA的3'UTR結(jié)合下調(diào)其基因表達(dá)；而miRNA在轉(zhuǎn)錄階段也可受到同一轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子可通過(guò)與miRNA基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)miRNA的轉(zhuǎn)錄；兩者之間形成一種反饋調(diào)控關(guān)系，這種調(diào)控關(guān)系模塊稱之為反饋環(huán)（feedback loop，F(xiàn)BL）。此外，轉(zhuǎn)錄因子除了直接調(diào)控靶基因，還可通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA轉(zhuǎn)錄間接調(diào)控同一靶基因表達(dá)，這樣轉(zhuǎn)錄因子、miRNA和靶基因三者之間就形成了一種前饋調(diào)控關(guān)系，這種調(diào)控關(guān)系模塊稱之為前饋環(huán)（feedforward loop，F(xiàn)FL）。根據(jù)前饋環(huán)中起主導(dǎo)作用的調(diào)控因子不同，可將前饋環(huán)分為miRNA主導(dǎo)的前饋環(huán)（miRNA-FFL）、轉(zhuǎn)錄因子主導(dǎo)的前饋環(huán)（TF-FFL）以及復(fù)合的前饋環(huán)（composite FFL）三種形式[14，15]。miRNA與轉(zhuǎn)錄因子的前饋環(huán)和反饋環(huán)共調(diào)控作用是哺乳動(dòng)物體內(nèi)一種重要的基因調(diào)控模式。

為了探討miRNA與轉(zhuǎn)錄因子在B-ALL中的作用機(jī)制，本研究應(yīng)用Illumina測(cè)序和轉(zhuǎn)錄因子芯片技術(shù)，對(duì)成人B-ALL與非惡性血液病對(duì)照組骨髓樣本的miRNA和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平進(jìn)行了對(duì)比分析，兩組樣本共檢測(cè)出差異表達(dá)的miRNA 291個(gè)（168個(gè)miRNA在B-ALL組呈表達(dá)上調(diào)，123個(gè)miRNA呈表達(dá)下調(diào)）以及差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子201個(gè)（57個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在B-ALL組呈表達(dá)上調(diào)，144個(gè)呈表達(dá)下調(diào)）。隨后，我們應(yīng)用qPCR技術(shù)分別驗(yàn)證了Illumina測(cè)序以及轉(zhuǎn)錄因子芯片檢測(cè)結(jié)果的可靠性。通過(guò)運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)方法，將miRNA和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)譜與miRNA靶基因預(yù)測(cè)以及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)等生物信息學(xué)分析相結(jié)合，本研究首次構(gòu)建了成人B-ALL的miRNA-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從中鑒定出526個(gè)FFL以及9個(gè)FBL調(diào)控模塊。有研究報(bào)道，F(xiàn)FL可作為基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心，在疾病分子機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在這些調(diào)控模塊中TF-FFL占絕大多數(shù)（93.5%）。這與文獻(xiàn)報(bào)道在B淋巴細(xì)胞發(fā)育的miRNA-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中其主要的調(diào)控模塊為TF-FFL基本一致[16]；提示TF-FFL在B細(xì)胞發(fā)育以及B-ALL發(fā)病機(jī)制中可能具有重要作用。

為了評(píng)估網(wǎng)絡(luò)的功能特性，本研究利用功能注釋工具GO數(shù)據(jù)庫(kù)以及KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行了GO分析和Pathway分析。GO分析結(jié)果表明，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)主要參與了包括基因表達(dá)的正性調(diào)控、大分子代謝過(guò)程的正性調(diào)控、造血或淋巴樣器官發(fā)育等10個(gè)生物學(xué)過(guò)程。其中，一半的生物學(xué)過(guò)程（包括基因表達(dá)的正性調(diào)控、造血或淋巴樣器官發(fā)育、造血、DNA依賴性的轉(zhuǎn)錄正性調(diào)控以及大分子生物合成的正性調(diào)控5個(gè)生物學(xué)過(guò)程）與B-ALL的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Pathway分析結(jié)果表明，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)主要富集在癌癥信號(hào)通路、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)信號(hào)通路以及慢性髓性白血病信號(hào)通路等25個(gè)信號(hào)通路。其中，PI3K-Akt信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路以及細(xì)胞周期信號(hào)通路為目前已知的與 B-ALL 發(fā)病相關(guān)的信號(hào)通路[8，9，17～20]。此外，我們選擇連通度≥10的節(jié)點(diǎn)作為中心節(jié)點(diǎn)，鑒定出47個(gè)核心調(diào)控因子，包括28個(gè)核心miRNA和19個(gè)核心轉(zhuǎn)錄因子。在這些核心調(diào)控因子中，4個(gè)核心 miRNA（包括 miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-18a-5p和miR-34a-5p）以及5個(gè)核心轉(zhuǎn)錄因子（包括MYC、STAT5A、STAT5B、FOXO1和HLF）已有文獻(xiàn)報(bào)道與B-ALL發(fā)病機(jī)制相關(guān)；其余的24個(gè)核心miRNA和14個(gè)核心轉(zhuǎn)錄因子為新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控因子。

綜上所述，本研究首次構(gòu)建了成人B-ALL的miRNA-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從整體水平上闡述miRNA和轉(zhuǎn)錄因子對(duì)B-ALL相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制。多種核心調(diào)控因子可能成為B-ALL潛在的分子靶點(diǎn)，用于B-ALL發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究。