基于探針熔解曲線分析技術(shù)的非缺失型地中海貧血基因檢測(cè)方法的建立*

胡曉艷， 吳宇亮， 李科錚， 鐘宇萍， 徐頌周， 王存艷

1北京大學(xué)深圳醫(yī)院新生兒科(廣東深圳 518036)； 2深圳鼎新融合科技有限公司研發(fā)中心(廣東深圳 518101)

地中海貧血是全球發(fā)病率最高的常染色體單基因隱性遺傳病，輕型地中海貧血對(duì)健康無(wú)明顯影響，而重型地中海貧血?jiǎng)t是嚴(yán)重危害人類健康的疾病。目前防治地中海貧血最行之有效的方法是加強(qiáng)高危人群的篩查，避免重型地中海貧血新生兒的出生，基因檢測(cè)是地中海貧血篩查中最準(zhǔn)確、最有效的手段[1]。目前臨床上檢測(cè)缺失型地中海貧血基因的方法主要是跨越斷裂點(diǎn) PCR 法(gap-PCR)，該方法具有其快速簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)準(zhǔn)確的特點(diǎn)[2]。檢測(cè)非缺失型α和β地中海貧血基因主要采用反向斑點(diǎn)雜交法[3-4]，該方法存在檢測(cè)步驟繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)成本高等缺陷。文獻(xiàn)報(bào)道[5-7]用多重不對(duì)稱PCR探針熔解曲線法進(jìn)行基因檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、成本低、污染風(fēng)險(xiǎn)小的優(yōu)勢(shì)，但未見(jiàn)有將該方法用于地中海貧血基因檢測(cè)的報(bào)道。2017年6月1日至2018年10月31日，本研究將開(kāi)發(fā)一種用于地中海貧血基因檢測(cè)的多重不對(duì)稱PCR探針熔解曲線法，對(duì)每個(gè)待測(cè)的基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)一條特異的熒光探針，根據(jù)該探針與特定等位基因結(jié)合后的熔解溫度不同來(lái)實(shí)現(xiàn)非缺失型地中海貧血基因位點(diǎn)的檢測(cè)。我國(guó)常見(jiàn)的非缺失型α和β地中海貧血基因位點(diǎn)主要包括以下9個(gè)[8-9]：αWSα、αQSα、αCSα、βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、βCD-71-72、βCD-26，我們的方法將針對(duì)這9個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 臨床標(biāo)本由北京大學(xué)深圳醫(yī)院提供(30份已知基因型別的地貧血液標(biāo)本，200份臨床疑似地貧的標(biāo)本，乙二胺四乙酸抗凝，-20℃保存)，PCR引物、探針及靶序列由上海生工合成，全血基因組DAN提取試劑盒(Simgen)，Taq HS酶和UNG酶(Takara)，10×PCR Buffer(上海生工)，dNTP 和dUTP(Takara)，非缺失型α地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒(益生堂)，β地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒(益生堂)，熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96)。

1.2 方法

1.2.1 引物、探針及靶序列 從NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)上下載9個(gè)位點(diǎn)(αWSα、αQSα、βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、αCSα、βCD-71-72、βCD-26)基因序列，根據(jù)位點(diǎn)所在的上下游15～25 bp的序列設(shè)計(jì)的探針和靶序列，并用Primer3.0在線設(shè)計(jì)8個(gè)引物對(duì)，其中αWSα、αQSα因?yàn)橄喔糨^近可以共用1對(duì)引物以及同一個(gè)熒光探針。每個(gè)熒光探針各占用1個(gè)熒光通道，共分兩組反應(yīng)管，見(jiàn)表1。其中TW為依據(jù)該位點(diǎn)的野生型序列設(shè)計(jì)的靶序列，TM為依據(jù)該位點(diǎn)的突變序列設(shè)計(jì)的靶序列，將TW與TM按照1∶1的濃度混合，則可得到該位點(diǎn)雜合型的靶序列。

1.2.2 探針與靶序列熔解曲線效果驗(yàn)證 (1)反應(yīng)體系：2.5 μL的10×PCR Buffer，4 μL的熒光探針(對(duì)應(yīng)個(gè)型別的熒光探針終濃度各0.2 μmol/L)，4 μL的靶序列(對(duì)應(yīng)個(gè)型別的靶序列終濃度各0.2 μmol/L)，3 μL的25 mmol/L MgCl2，2 μL的dNTP，補(bǔ)ddH2O至25 μL。(2)反應(yīng)條件：步驟一，95℃ 30 s；步驟二，30℃ 30 s；步驟三，運(yùn)行熔解曲線程序，0.3℃/s的升溫速率從30～90℃遞增進(jìn)行熔解曲線分析，每隔 0.6℃采集FAM、HEX、Texas Red、Cy5熒光；步驟四，12℃ 2 min。使用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀自帶的軟件機(jī)進(jìn)行熔解曲線峰溫度判讀。

1.2.3 多重PCR與熔解曲線實(shí)驗(yàn)流程 (1)反應(yīng)體系：2.5 μL的10×PCR Buffer，12 μL的引物探針MIX(反應(yīng)管a各探針終濃度：Pa1、Pa2為0.1 μmol/L，Pa3、Pa4為0.2 μmol/L；反應(yīng)管b各探針終濃度：Pb1、Pb2為0.1 μmol/L，Pb3、Pb4為0.2 μmol/L；a和b兩管各上游引物F終濃度為0.04 μmol/L，下游引物R終濃度為0.4 μmol/L)，0.25 μL的UNG酶，1 μL的HS Taq酶，3.75 μL的25 mmol/L MgCl2，2 μL的dNTP，補(bǔ)ddH2O至25 μL。(2)反應(yīng)條件：步驟一:25℃ 10 min；步驟二:95～94℃ 7 min；步驟三：95～94℃ 30 s，65℃ 20 s(每個(gè)循環(huán)降低1℃)，72℃ 15 s;(10個(gè)循環(huán))；步驟四：95～94℃ 15 s，58～60℃ 15 s，72℃ 15 s;(40 個(gè)循環(huán))；步驟五：95℃ 30 s；步驟六：30℃ 30 s；步驟七：0.3℃/s的升溫速率30～90℃遞增進(jìn)行熔解曲線分析，每隔 0.6℃采集FAM、HEX、Texas Red、Cy5熒光；步驟八：12℃ 2 min。使用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀自帶的軟件機(jī)進(jìn)行熔解曲線峰溫度判讀。

1.2.4 地中海貧血基因檢測(cè)對(duì)照實(shí)驗(yàn) 收集2018年1—9月在北京大學(xué)深圳醫(yī)院就診疑似地中海貧血病例的血液樣本200例，本研究疑似地中海貧血的標(biāo)準(zhǔn)定為符合下列任一項(xiàng)者：(1)有地中海貧血家族史者；(2)外周血紅細(xì)胞體積(MCV)<60 fL者。使用商用地中海貧血試劑盒(非缺失型α地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒、β地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒，均使用反向斑點(diǎn)雜交法)，以及本研究開(kāi)發(fā)的PCR探針熔解曲線法及試劑對(duì)收集的200例血液樣本進(jìn)行檢測(cè)。商用地中海貧血試劑盒具體操作步驟及判讀標(biāo)準(zhǔn)均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。本研究經(jīng)北京大學(xué)深圳醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選病例均取得患者或監(jiān)護(hù)人同意并簽署之情同意書(shū)。

2 結(jié)果

2.1 靶序列熔解曲線峰值檢測(cè) 使用各位點(diǎn)的TW靶序列、TM靶序列、TW+TM混合靶序列，作為模板進(jìn)行熔解曲線分析，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以見(jiàn)到熔解峰均存在較大的差異，本研究設(shè)計(jì)的檢測(cè)探針可以很好地對(duì)αWSα、αQSα、βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、αCSα、βCD-71-72、βCD-26等9個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。

表1 地中海貧血基因位點(diǎn)探針、引物序列與反應(yīng)管編號(hào)

2.2 已知型別的臨床樣本的熔解曲線峰值檢測(cè) 使用多重不對(duì)稱PCR探針熔解曲線法對(duì)30份已知型的地貧血液標(biāo)本進(jìn)行分析，檢測(cè)到的各種基因型別按照FAM、HEX、Texas Red和Cy5檢測(cè)通道的熔解曲線結(jié)果見(jiàn)圖2。根據(jù)軟件判讀的熔解曲線的Tm值不同可以分辨不同的亞型，9個(gè)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的Tm值及基因型見(jiàn)表2。其中，βIVSⅡ654，受旁邊SNP的影響，雜合子和野生型峰型個(gè)有2種，對(duì)應(yīng)的Tm值也有兩種。

圖1 地中海貧血的基因位點(diǎn)靶序列的熔解曲線

圖2 地中海貧血的基因位點(diǎn)臨床樣本的熔解曲線

2.3 兩種方法檢測(cè)地中海貧血基因位點(diǎn)結(jié)果比較 200例臨床樣本中，共檢出69例目標(biāo)突變基因，檢出率34.5%，發(fā)生率最高的前兩位突變類型是CD41-42和IVS-Ⅱ-654，探針熔解曲線法的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的反向斑點(diǎn)雜交法完全符合，見(jiàn)表3。

表2 地中海貧血的基因位點(diǎn)的熔解曲線Tm值

2.4 兩種方法檢測(cè)地中海貧血優(yōu)缺點(diǎn)比較 經(jīng)過(guò)臨床樣本的檢測(cè)與方法學(xué)的比較，本項(xiàng)目開(kāi)發(fā)的探針熔解曲線法相比與反向斑點(diǎn)雜交法將原有的DNA提取、PCR擴(kuò)增、雜交、洗膜、顯色等步驟縮減為DNA提取、PCR擴(kuò)增與熔解曲線分析兩步，大大縮短了檢測(cè)的時(shí)間，降低了樣本污染的風(fēng)險(xiǎn)以及檢測(cè)成本，見(jiàn)表4。

表3 兩種方法檢測(cè)200例臨床樣本結(jié)果比較 例(%)

表4 探針熔解曲線法、反向斑點(diǎn)雜交法的方法學(xué)對(duì)比

3 討論

地中海貧血是由于組成血紅蛋白的珠蛋白基因缺陷，使珠蛋白肽鏈1種或幾種合成減少或不能合成，而導(dǎo)致的一種溶血性貧血，根據(jù)缺陷的珠蛋白肽鏈種類主要分為α-地中海貧血和β-地中海貧血。我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)是地中海貧血高發(fā)區(qū)，尤其是廣東、廣西、海南發(fā)病率最高，其中海南黎族人群地中海貧血基因攜帶率高達(dá)65%[10]。重型地中海貧血是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，重型α-地中海貧血多在胎兒期或出生后數(shù)小時(shí)死亡，重型β-地中海貧血需終身輸血治療，造成了嚴(yán)重的家庭、社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[11-12]。加強(qiáng)高危人群的篩查，避免重型地中海貧血新生兒的出生是地中海貧血防治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此建立一種快速、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確率高的地中海貧血基因檢測(cè)方法，是地中海貧血防治的重點(diǎn)。

目前用探針熔解曲線法檢測(cè)非缺失型α和β地中海貧血基因突變的很少，已報(bào)道的有分子信標(biāo)探針?lè)╗13-14]，用分子信標(biāo)探針檢測(cè)SNP分型的原理是設(shè)計(jì)一條與靶序列產(chǎn)物匹配的探針，人工添加兩端或其中一端的堿基，使探針在低溫下兩端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，3′端的淬滅劑淬滅5′端的熒光報(bào)告分子，隨著溫度的升高，莖結(jié)構(gòu)被破壞，熒光報(bào)告分子與淬滅劑相互分離，熒光報(bào)告分子得以發(fā)射熒光。在探針與靶序列熔解的過(guò)程中，不同匹配度的靶序列的Tm值不同，從而可以達(dá)到SNP單堿基分辨的目的。但是分子信標(biāo)探針設(shè)計(jì)難，其莖環(huán)結(jié)構(gòu)容易使錯(cuò)配的靶序列結(jié)合效率低甚至結(jié)合不上，需要進(jìn)行大量設(shè)計(jì)合成探針和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證才能選出合適的探針，且理論的Tm值與實(shí)際的Tm值區(qū)別大，不容易僅在設(shè)計(jì)層次就預(yù)測(cè)出合適的探針。

本研究設(shè)計(jì)的探針與分子信標(biāo)探針不同，不在任何位置添加堿基，從而避免了增加錯(cuò)配，提高了當(dāng)?shù)任换蚺c探針不匹配時(shí)的結(jié)合效率。且我們這種方法的探針與靶序列的預(yù)測(cè)的理論Tm值與實(shí)際實(shí)驗(yàn)的Tm值基本一致，也就是可以在設(shè)計(jì)層次上就得出最合適的探針，不用通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證篩選出合適的探針。

通過(guò)對(duì)方法學(xué)的改良，本研究成功建立了一種檢測(cè)9個(gè)常見(jiàn)的非缺失型α和β地中海貧血的基因位點(diǎn)(αWSα、αQSα、βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、αCSα、βCD-71-72、βCD-26)的實(shí)驗(yàn)方法，且只需要使用2個(gè)PCR孔即可對(duì)9種常見(jiàn)突變型進(jìn)行檢測(cè)，只需要DNA提取、PCR擴(kuò)增與熔解曲線分析兩步，無(wú)需反向斑點(diǎn)雜交法的雜交、洗膜、顯色等步驟，大大簡(jiǎn)化了操作步驟，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，降低了氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)。本研究也使用了反向斑點(diǎn)雜交法對(duì)200例臨床樣本進(jìn)行了平行試驗(yàn)對(duì)比，兩種方法的匹配度完全一致，檢出率均為檢出率34.5%，對(duì)不同地貧類型的判斷完全一致。

本研究成功建立了一種可同時(shí)檢測(cè)9個(gè)常見(jiàn)的非缺失型α和β地中海貧血的基因位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)方法，該方法可在目前臨床常見(jiàn)的熒光定量PCR儀上進(jìn)行閉管操作，只需要DNA提取、PCR擴(kuò)增與熔解曲線分析兩步，檢測(cè)結(jié)果與反向斑點(diǎn)雜交法一致，具有準(zhǔn)確、方便、快速、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床非缺失型α和β地中海貧血檢測(cè)，該方法也可推廣到對(duì)其他單基因遺傳病的檢測(cè)中，有著廣闊的應(yīng)用前景。