改進(jìn)后的驗(yàn)證SREBP-1c下游調(diào)控基因的染色質(zhì)免疫共沉淀方法*

李建寧, 李旺, 楊玲玲, 李雨涵, 祁慧, 宋輝, 李巖, 楊怡△

寧夏醫(yī)科大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系, 2內(nèi)分泌研究所(寧夏銀川 750004)

染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序技術(shù)(chromatin immunoprecipitation followed by sequencing，ChIP-Seq)創(chuàng)建于2007年，現(xiàn)在已經(jīng)成為在全基因組范圍內(nèi)分析轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳學(xué)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，該項(xiàng)技術(shù)的原理也已被論證無誤且被應(yīng)用到多種研究領(lǐng)域中[1-3]。染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin co-immunoprecipitation, CHIP)在其中的作用是將待測(cè)序DNA提取出來，常規(guī)染色質(zhì)共沉淀方法處理組織或細(xì)胞時(shí)存在著實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、樣品DNA回收率低及PCR擴(kuò)增雜帶多等多種欠缺與弊端[2-3]。本課題組長(zhǎng)期致力于脂質(zhì)合成代謝機(jī)制的研究，其中固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding proteins, SREBPs)是體內(nèi)重要的一種核轉(zhuǎn)錄因子，其亞類SREBP-1c是我們感興趣的目標(biāo)基因之一，該研究通過對(duì)CHIP方法的改進(jìn)，更高效驗(yàn)證SREBP-1c下游的調(diào)控基因，此種改進(jìn)目前尚未見相關(guān)報(bào)道，為以后研究細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)相互作用奠定了新的方法學(xué)基礎(chǔ)。2016年8月至2017年3月，本研究以SREBP-1c下游調(diào)控基因?yàn)槔?，?duì)HEK 293T細(xì)胞進(jìn)行調(diào)整后的染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，通過改進(jìn)以期獲得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使細(xì)胞中基因表達(dá)調(diào)控研究中DNA提取與鑒定更高效。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 HEK 293T細(xì)胞購(gòu)自ATCC；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司(10099-141)；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司(SH30022)；PCR擴(kuò)增高保真酶HiFi購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司(AP131-02)；SREBP-1(H-160)抗體(sc-8984)和Protein A beads (sc-2003)購(gòu)自于Santa Cruz Biotechnology公司；IgG抗體購(gòu)自于Proteintech公司(30000-0-AP)；基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司(CW2298S)；蛋白酶K購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司(GE201-01)。

1.2 CHIP實(shí)驗(yàn)流程 常規(guī)CHIP一般包括以下9個(gè)步驟：細(xì)胞處理、交聯(lián)、超聲裂解、抗體與磁珠耦合、孵育、洗滌、解交聯(lián)、純化及PCR。本課題組改進(jìn)后的CHIP步驟包括：交聯(lián)后處理、樣品-抗體-磁珠孵育、3步洗滌、解交聯(lián)條件、純化方式。

1.2.1 細(xì)胞處理 將293T細(xì)胞以3.8×105平鋪于60 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h，用預(yù)冷的PBS清洗2次。

1.2.2 交聯(lián) 加入2.0 mL 1%多聚甲醛，室溫反應(yīng)5 min；立即加入200.0 μL 127.0 mmol/L甘氨酸終止反應(yīng)5 min；用含有1.0 mmol/L PMSF的預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞2次，最后加入2.0 mL含有PMSF的預(yù)冷PBS吹打細(xì)胞并收集，于4℃ 800×g離心10 min，棄上清。

1.2.3 超聲裂解 加入1.0 mL細(xì)胞裂解液RIPA buffer(100.0 mmol/L Tris/HCl, 5.0 mmol/L EDTA, 500.0 mmol/L NaCl, 5.0 mmol/L PMSF, 1.25% SDS, pH=7.5)，置于冰水浴中超聲裂解染色質(zhì)(功率 25% W，超聲 4.5 s，間歇 9.0 s，重復(fù)14～16次)。通過核酸凝膠圖像評(píng)價(jià)超聲裂解的效果。

1.2.4 樣品-抗體-磁珠耦合與孵育 首先對(duì)孵育樣品分組：不加抗體組，記作Mock；加陰性對(duì)照抗體組，記作IgG；加特異性抗體組，記作SREBP-1c。然后分別向50.0 μg染色質(zhì)中加入50.0 μL Protein A磁珠，于4℃ 旋轉(zhuǎn)3 h，用含有PMSF的預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞2次，于4℃ 800×g離心5 min，棄沉淀；然后加入7.0 μg SREBP-1c抗體和陰性對(duì)照IgG抗體，于4℃ 旋轉(zhuǎn)過夜；最后加入50 μL Protein A磁珠，于4℃ 旋轉(zhuǎn)3 h。

1.2.5 洗滌 連續(xù)分別加入1.0 mL RIPA buffer(10.0 mmol/L Tris/HCl, 1.0 mmol/L EDTA, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 140.0 mmol/L NaCl, 0.1% 脫氧膽酸鈉, 1.0 mmol/L PMSF, pH=7.4)，氯化鉀溶液 (1.0 mmol/L Tris/HCl, 250.0 mmol/L LiCl, 0.5% 乙基苯基聚乙二醇 P40, 0.5% 脫氧膽酸鈉, 1.0 mmol/L EDTA, pH=7.4)和Tris-EDTA buffer (1.0 mmol/L EDTA, 10.0 mmol/L Tris/HCl, pH=7.4)，于4℃ 旋轉(zhuǎn)混勻10 min，并于4℃ 800×g離心5 min。

1.2.6 交聯(lián) 向免疫復(fù)合物和作為Input組的超聲裂解染色質(zhì)中加入20.0 μL 蛋白酶K，56℃水浴10 min，于4℃ 800×g離心10 min，棄沉淀。

1.2.7 基因組DNA純化 使用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供的通用型基因組提取試劑盒，按照相關(guān)試劑盒操作流程，純化DNA，加入100.0 μL滅菌雙蒸水溶解DNA。

1.2.8 引物設(shè)計(jì) 依據(jù)Dif等[4]報(bào)道，設(shè)計(jì)SREBP-1c啟動(dòng)子區(qū)上下游引物： sense primer: 5′-GCTCAGGGTGCCAGCGAACCAGTG-3′；antisense primer: 5′-GGGTTACTAGCGGACGTCCGCC-3′，由上海生工合成。

1.2.9 PCR擴(kuò)增體系 5.0 μL含Mg2+buffer，4.0 μL dNTP，10.0 mmol/L引物各1.0 μL，基因組DNA模板1.0 μL，HiFi高保真酶0.5 μL；PCR循環(huán)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)次數(shù)30次，72℃延伸5 min。3%瓊脂糖凝膠電泳，使用Bio-Red核酸凝膠成像儀采集PCR結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 SREBP-1c 啟動(dòng)子區(qū)的分析 我們發(fā)現(xiàn)SREBP-1c的2個(gè)SRE元件分別坐落在-288/218 bp區(qū)(5′-TTCACCCCGC-3′)和-127/-117 bp區(qū)(5′-CTCACCCCAT-3′)，并與5′-TCACNCCAC-3′核心序列高度一致，見圖1。下劃紅線顯示的區(qū)域?yàn)镾RE元件區(qū)，并能與SREBP-1c蛋白特異性結(jié)合，促進(jìn)自身轉(zhuǎn)錄。

2.2 檢驗(yàn)染色質(zhì)超聲破碎的效果 3%瓊脂糖核酸電泳圖顯示，多數(shù)DNA片段分布在100～200 bp之間，沒有其他雜帶出現(xiàn)，顯示改進(jìn)后的效果較好，見圖2。

2.3 解交聯(lián)結(jié)果 在解交聯(lián)時(shí)，我們采用蛋白酶K在56℃水浴10 min，直接去除結(jié)合的蛋白質(zhì)，見圖3。

2.4 DNA純化及PCR PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：苯酚/氯仿提純的DNA在Input組出現(xiàn)PCR擴(kuò)增雜帶多，而且SREBP-1c抗體沉淀組PCR擴(kuò)增效率極低；反而基因組提取試劑盒法在Input組和特異性SREBP-1c抗體沉淀組PCR擴(kuò)增效果明顯優(yōu)于苯酚/氯仿提純法，見圖4。

3 討論

SREBPs是體內(nèi)重要的一種核轉(zhuǎn)錄因子，已經(jīng)確定的SREBPs家族有3種基因：SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2，其中SREBP-1a和SREBP-1c傾向于脂肪酸合成的調(diào)節(jié)，而SREBP-2主要參與調(diào)節(jié)膽固醇合成[5-7]。SREBP前體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，通過水解蛋白S1P(site 1 protease)和S2P(site 2 protease)裂解為成熟SREBP，隨后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中與靶基因固醇調(diào)節(jié)元件(sterol regulatory element, SRE)結(jié)合，從而激活下游調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)脂肪酸合成[8-9]，調(diào)節(jié)膽固醇的合成[10]。已有研究發(fā)現(xiàn)通過激活SREBP抑制SELENOP表達(dá)達(dá)到調(diào)控胰島素敏感性的目的[11]。非固醇介導(dǎo)的SREBP由其他因子激活，比如切應(yīng)力、多種生長(zhǎng)因子、葡萄糖等，而且也是通過相同的途徑[12]。不同共刺激因子的募集使得由SREBP調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄呈現(xiàn)特異性[13]。

圖1 SREBP-1c 啟動(dòng)子區(qū)-SRE元件結(jié)合區(qū)(-419/+90 bp)

條帶A、B、C為HEK 293T 培養(yǎng)細(xì)胞裂解超聲后染色質(zhì)結(jié)果

ChIP-Seq技術(shù)主要利用抗原抗體反應(yīng)的特異性，可在體內(nèi)用來確定與某一特定蛋白結(jié)合或蛋白定位所在的特異性DNA序列的技術(shù)，使我們了解在自然狀態(tài)下基因是如何被調(diào)控的，較真實(shí)地反映與DNA直接或間接結(jié)合的調(diào)控蛋白，是研究體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的主要技術(shù)[14-15]。例如高等生物的基因組DNA上結(jié)合有組蛋白，組蛋白修飾是可改變的表觀遺傳機(jī)制，通過組蛋白乙?；⒓谆?、磷酸化、泛素化和多聚ADP糖基化等不同的修飾作用，影響基因的轉(zhuǎn)錄[16]。ChIP-Seq技術(shù)的關(guān)鍵操作步驟即CHIP實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)的目的是將待測(cè)序的DNA從樣品中提取出來，提供后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需的DNA條帶，所以，實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵在于如何短時(shí)間內(nèi)提取到高純度、高穩(wěn)定性的目標(biāo)DNA分子，常規(guī)CHIP的缺點(diǎn)如前言所述[2-3]。通過SREBP相關(guān)實(shí)驗(yàn)中的CHIP改進(jìn)，使得該方法的操作流程更快速、方便，結(jié)果更穩(wěn)定、可靠。改進(jìn)后的CHIP方法，將細(xì)胞染色質(zhì)通過交聯(lián)、超聲裂解、抗體與磁珠耦合、洗滌、去除蛋白質(zhì)和純化共6步處理后，得到了富集有靶序列的DNA片段，且DNA樣品質(zhì)量達(dá)到PCR擴(kuò)增要求；將樣品進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果背景干凈、重復(fù)性高。與常規(guī)CHIP流程相比，我們通過采取縮短交聯(lián)時(shí)間，加入含有PMSF的PBS緩沖液和RIPA裂解液等來避免DNA結(jié)合后的蛋白質(zhì)迅速發(fā)生降解，確保反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性，減少不必要的損失。在洗滌過程中，我們采用3步洗滌，即分別為RIPA buffer、LiCl buffer和Tris-EDTA buffer進(jìn)行，極大地縮減了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，減少了操作誤差。隨后我們應(yīng)用蛋白酶K，56℃水浴10 min，解除蛋白質(zhì)與DNA的交聯(lián)，同樣使得實(shí)驗(yàn)時(shí)間合理縮短，并因此保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用基因組提取試劑盒法進(jìn)行，比較于苯酚/氯仿提純法，在Input組和特異性SREBP-1c抗體沉淀組PCR擴(kuò)增效果明顯優(yōu)于后者，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定可靠。盡管該改進(jìn)方法中的部分步驟有文章進(jìn)行了實(shí)際應(yīng)用，并取得了良好實(shí)驗(yàn)結(jié)果[4,17]，我們首次將整個(gè)流程中的部分重要步驟重新進(jìn)行分析，并合理整合、優(yōu)化，從而將實(shí)驗(yàn)時(shí)間縮短，時(shí)間誤差縮小(例如孵育時(shí)間縮短，清洗過程也加入DNA保護(hù)試劑等)。在這樣的整合與優(yōu)化后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠準(zhǔn)確反映因子之間的相互作用，確保了該方法的可信度。改進(jìn)后的CHIP實(shí)驗(yàn)具有快速、操作簡(jiǎn)便、縮小誤差、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，不僅為特異性因子SREBP實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用提供了技術(shù)支持，也為其他類似反應(yīng)原理的相互作用驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，并具有實(shí)踐指導(dǎo)意義的基礎(chǔ)。本改進(jìn)僅局限于SREBP在HEK 293T細(xì)胞染色質(zhì)免疫共沉淀中，尚有很多不足：如樣本量少，參照設(shè)置不嚴(yán)謹(jǐn)，以及具體條件未予以分組對(duì)照等。作為一項(xiàng)技術(shù)，下一步的研究方向在于擴(kuò)大樣本量，增加對(duì)照，選擇不同的靶點(diǎn)分子與細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證。

圖3 改進(jìn)后CHIP孵育與解交聯(lián)流程

圖4 CHIP檢測(cè)SREBP-1c調(diào)節(jié)自身上游啟動(dòng)子區(qū)

以上結(jié)果說明，改進(jìn)后的方法更適用于HEK 293T細(xì)胞CHIP，使細(xì)胞中基因表達(dá)調(diào)控區(qū)DNA提取鑒定方法更高效，更方便，該方法也為研究代謝研究中相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控(包括其他多種類型細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)的相互作用)奠定了技術(shù)與方法基礎(chǔ)。應(yīng)用改進(jìn)后的方法，我們已經(jīng)獲得了相關(guān)課題的后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并完成了文章撰寫，該結(jié)果另文發(fā)表。