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    7種海參提取物酶法制備及其抗氧化活性研究

    2019-10-12 06:01:44趙謀明孫為正趙強(qiáng)忠林戀竹
    中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2019年9期
    關(guān)鍵詞:力值海參木瓜

    楊 坤 趙謀明 孫為正 趙強(qiáng)忠 林戀竹

    (華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 廣州 510640)

    海參屬棘皮動(dòng)物門、海參綱[1],是海洋中最常見(jiàn)的無(wú)脊椎動(dòng)物。據(jù)報(bào)道,全世界已發(fā)現(xiàn)的海參大約有1 100種,其中40種可供食用;我國(guó)總計(jì)約有100種,其中約20種可供食用[2]。新鮮海參體內(nèi)含有活性很強(qiáng)的自溶酶[3],在受到外界物理因素、化學(xué)因素和生理因素等刺激后,原本正常的生命活動(dòng)出現(xiàn)紊亂,會(huì)發(fā)生吐腸和體壁軟化的現(xiàn)象[4],在捕獲后需快速進(jìn)行干制處理。市場(chǎng)上流通量最大的海參制品為干制海參,約占到市場(chǎng)上海參制品量的90%[5]。

    海參具有高蛋白、低脂肪的特點(diǎn)[6]。海參中豐富的蛋白、多糖和皂甙,是其發(fā)揮抗衰老、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力和降血脂等多種生理功效的主要活性物質(zhì)[7]。其中,膠原蛋白是海參中含量最多的活性物質(zhì),占海參蛋白的70%以上[8]。中國(guó)產(chǎn)刺參膠原蛋白中甘氨酸和羥脯氨酸含量較多,酪氨酸、苯丙氨酸和組氨酸含量較低,與人Ⅰ型膠原蛋白的氨基酸組成相近,生物利用度較高[9-12]。海參多糖是海參體壁中含量?jī)H次于蛋白質(zhì)的另一重要成分,其分為兩種:一種為硫酸軟骨素,為分支雜多糖,另一種是巖藻聚糖,為直鏈多糖。二者均有較高含量的硫酸酯質(zhì),約占其總質(zhì)量的30%[13-16]。

    本文在前人研究的基礎(chǔ)上,以小北極海參、大北極海參、葉瓜參、花刺參、土耳其長(zhǎng)崎參、大連大烏參、澳洲參為研究對(duì)象,采用3種蛋白酶——復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶分別水解4,8,12 h,制備得到海參提取物,采用還原力、羥自由基清除能力、氧自由基吸收能力評(píng)價(jià)法對(duì)比研究其抗氧化活性,為以海參提取物為核心配料的功能性食品的加工提供理論支持。

    1 材料與方法

    1.1 原料

    小北極海參、大北極海參、葉瓜參、花刺參、土耳其參、大連大烏參、澳洲參,采購(gòu)自廣州市一德路干貨批發(fā)市場(chǎng),置于陰涼干燥處備用。

    1.2 試劑

    復(fù)合蛋白酶(酶活為46 000 U/g),風(fēng)味蛋白酶(酶活為40 000 U/g),購(gòu)于丹麥諾維信公司;木瓜蛋白酶(酶活為56 000 U/g),購(gòu)于廣州裕立寶生物科技公司;AAPH,熒光素,trolox,純度為 99%,購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;其它試劑均為分析純,購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠;去離子水,實(shí)驗(yàn)室自制。

    1.3 設(shè)備

    絞肉機(jī)(MM12),廣東省韶關(guān)市食品機(jī)械廠;pH計(jì)(PHS-2F),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;阿貝折光儀(E-line),香港德祥科技有限公司;電熱恒溫水浴鍋(HH-S1),金壇華特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;分析天平(AL204),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;烘箱(101-3A),上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司;酶標(biāo)儀(Varioskan Flash),美國(guó)Thermo公司;紫外分光光度計(jì)(UV-721),上海精密科學(xué)儀器儀表有限公司;恒溫振蕩器(THZ-82A),常州澳華儀器有限公司;離心機(jī)(ST-16R),美國(guó)Thermo公司;自動(dòng)定氮儀(KND-103F),上海纖檢儀器有限公司。

    1.4 試驗(yàn)方法

    1.4.1 海參提取物酶法制備工藝研究 分別取干海參各 200 g,按料液比 1∶20(m/m)加入去離子水,15℃泡發(fā)48 h,冷水漂洗2次,瀝干多余的水分,稱重后,計(jì)算泡發(fā)增重倍數(shù),然后使用絞肉機(jī)絞碎海參,成肉糜狀,分別取海參肉糜各15 g,按料液比為1∶2(m/m)加入去離子水,分別加入肉糜質(zhì)量0.1%的酶(復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶),分別于55℃酶解4,8和12 h,95℃加熱15 min,4 000 g離心 20 min,取上清液,得海參提取物??疾旌⒎N類、酶的種類、酶解時(shí)間對(duì)海參提取物得率、蛋白回收率以及抗氧化活性的影響。

    1.4.2 泡發(fā)增重倍數(shù)測(cè)定 取m1質(zhì)量的干海參進(jìn)行泡發(fā),泡發(fā)完成后瀝干水分計(jì)重,質(zhì)量為m2。

    1.4.3 海參提取物得率的測(cè)定 取m3質(zhì)量的海參肉糜進(jìn)行酶解,海參提取物計(jì)重m4,使用阿貝折光儀測(cè)定提取物中固形物含量(b)。

    1.4.4 蛋白回收率的測(cè)定[17]采用凱氏定氮法(GB/T5009.5-2003)測(cè)定提取物中總氮量。

    式中:N1——海參提取物總氮量,g;N2——原料總氮量,g。

    1.4.5 海參提取物的還原力評(píng)價(jià)[18]取2 mL樣品,依次加入2 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH 6.6)和2 mL 1%(w/v)的鐵氰化鉀溶液,混勻,50℃保溫 20 min后,加入 2 mL 10%(w/v)的 TCA,混勻,4 000 g離心 10 min,取上清液 2 mL,依次加入2 mL蒸餾水以及 0.4 mL 0.1%(w/v)氯化鐵溶液,混勻,室溫反應(yīng)10 min后,測(cè)定其在700 nm 處的吸光度值。將trolox作為標(biāo)準(zhǔn)品,trolox濃度與其吸光度值呈線性關(guān)系,換算得到樣品的還原力值,即達(dá)到每克干海參的還原力所需trolox的量(μmol trolox當(dāng)量/g干海參),還原力值越大,樣品的還原力越強(qiáng)。

    1.4.6 海參提取物的羥基自由基清除能力評(píng)價(jià)[19-20]羥基自由基(OH)清除力的測(cè)定選用鄰二氮菲法。樣品管:取0.6 mL樣品溶液,加入0.4 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH 7.4),混勻,依次加入0.6 mL鄰二氮菲溶液(5 mmol/L)及0.6 mL EDTA(15 mmol/L),混勻后,加入 0.6 mL FeSO4溶液(5 mmol/L),充分混勻后加入0.8 mL 0.1%(V/V)H2O2。搖勻后于37℃保溫1 h,測(cè)定其在536 nm 處吸光值 A536(樣品);損傷管:以去離子水代替樣品,其余步驟同樣品管,所測(cè)吸光值為 A536(損傷);未損傷管:以去離子水代替H2O2,其余步驟同損傷管,所測(cè)吸光值為 A536(未損傷)。

    將trolox作為標(biāo)準(zhǔn)品,trolox濃度與其OH清除率呈線性關(guān)系,換算得到樣品的OH值,即達(dá)到每克干海參的OH清除能力所需Torlox的量(μmol trolox當(dāng)量/g干海參),OH值越大,樣品的OH清除能力越強(qiáng)。

    1.4.7 海參提取物的氧自由基吸收能力(ORAC)評(píng)價(jià)[21]在96孔熒光板各微孔中分別加入20 μL待測(cè)樣品或磷酸鹽緩沖液(75mmol/L,pH7.4),添加70 nmol/L熒光素120 μL,在37℃下保溫 15 min后,用多道移液器迅速在各孔中加入60 μL 12 mmol/L AAPH啟動(dòng)反應(yīng),并將微孔板置于酶標(biāo)儀中,保持反應(yīng)體系溫度恒定為37℃,設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)485 nm,發(fā)射波長(zhǎng)520 nm,開(kāi)始計(jì)時(shí)反應(yīng)并讀數(shù)(f0),每 1 min測(cè)定 1次,共讀 121次數(shù)(共計(jì)反應(yīng)120 min),將每次讀數(shù)連成曲線。Q表示曲線下的面積。

    Q=0.5(f0+fn)+(f1+f2+…+fi+…+fn-1)

    L=Q樣品-Q空白

    將trolox作為標(biāo)準(zhǔn)品,trolox濃度與其L呈線性關(guān)系,換算得到樣品的ORAC值,即達(dá)到每克干海參的氧自由基吸收能力所需Torlox的量(μmol trolox當(dāng)量/g干海參)。

    1.4.8 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 17.0軟件中的ANOVA方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)分析,以P<0.05為差異顯著,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)的形式來(lái)表示。聚類分析采用SPSS 17.0軟件中的系統(tǒng)聚類的方法。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 7種海參蛋白含量及泡發(fā)增重倍數(shù)

    7種海參蛋白含量及泡發(fā)增重倍數(shù)如表1所示。

    表1 7種海參蛋白含量及泡發(fā)增重倍數(shù)Table 1 Protein contents and soaked mulriples of seven kinds of sea cucumbers

    試驗(yàn)結(jié)果表明:7種干海參經(jīng)冷水泡發(fā)后,土耳其參增重倍數(shù)最高(3.24)。大連大烏參蛋白含量最高,達(dá)到60.62%。海參中最重要且含量最高的營(yíng)養(yǎng)成分是蛋白質(zhì),由于干海參制作時(shí)會(huì)添加大量的鹽,致使干海參中蛋白含量有所降低。不同等級(jí)、種類海參在鹽干時(shí),加入的鹽含量不同,因此,不同干海參蛋白含量差異較大。

    2.2 不同酶、酶解時(shí)間對(duì)7種海參提取物得率、蛋白回收率的影響

    2.2.1 不同酶、酶解時(shí)間對(duì)7種海參提取物得率的影響 不同酶、酶解時(shí)間對(duì)7種海參提取物得率的影響如圖1所示。

    圖1 酶解4,8,12 h不同酶對(duì)海參提取物得率的影響Fig.1 Effect of different enzymes on the sea cucumber extract yields in enzymolysis for 4,8,12 h

    試驗(yàn)結(jié)果表明:3種酶酶解海參4 h時(shí),7種海參提取物得率為17.68%~55.57%。采用復(fù)合蛋白酶酶解大連大烏參,其提取物得率最高,達(dá)到55.57%。對(duì)于7種海參,以土耳其參、小北極海參提取物得率較高,分別為38.3%~52.9%和38.17%~42.53%。對(duì)于3種蛋白酶,采用復(fù)合蛋白酶酶解7種海參,所得海參提取物得率最高。此外,采用木瓜蛋白酶酶解大連大烏參、葉瓜參、花刺參和大北極海參時(shí),所得海參提取物得率顯著高于采用風(fēng)味蛋白酶酶解這4種海參所得海參提取物得率(P<0.05)。然而,采用木瓜蛋白酶酶解土耳其參、澳洲海參和小北極海參時(shí),所得海參提取物得率與采用風(fēng)味蛋白酶酶解這3種海參所得海參提取物得率沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。當(dāng)采用3種酶酶解海參8 h時(shí),7種海參提取物得率為22.17%~57.76%,相對(duì)于酶解4 h時(shí)海參提取物得率有一定程度的提高,但提高幅度不大。3種酶酶解海參12 h時(shí),7種海參提取物得率介于21.57%~61.64%之間,相對(duì)于酶解4,8 h時(shí)海參提取物得率有一定程度的提高。

    2.2.2不同酶、酶解時(shí)間對(duì)7種海參蛋白回收率的影響 蛋白質(zhì)是海參中含量最高的營(yíng)養(yǎng)成分。因此,蛋白肽是海參提取物中最主要的成分,對(duì)海參提取物的活性有重要的貢獻(xiàn)。不同酶、酶解時(shí)間對(duì)7種海參蛋白回收率的影響如圖2所示。

    圖2 酶解4,8,12 h時(shí)7種海參蛋白回收率Fig.2 Protein recovery rates of 7 kinds of sea cucumbers in enzymolysis for 4,8,12 h

    試驗(yàn)結(jié)果表明:當(dāng)采用木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶以及風(fēng)味蛋白酶酶解不同海參4 h時(shí),7種海參的蛋白回收率為22.89%~96.48%。其中,采用復(fù)合蛋白酶酶解大北極海參時(shí),蛋白回收率最高,達(dá)到96.48%。對(duì)于3種蛋白酶,采用復(fù)合蛋白酶酶解7種海參時(shí),蛋白回收率最高,木瓜蛋白酶次之,而采用風(fēng)味蛋白酶酶解7種海參時(shí),蛋白回收率最低。

    當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至8 h時(shí),7種海參的蛋白回收率為29.18%~97.56%。采用復(fù)合蛋白酶酶解7種海參時(shí),蛋白回收率最高,其中以大北極海參酶解產(chǎn)物蛋白回收率為最高,木瓜蛋白酶次之,風(fēng)味蛋白酶最低。采用3種不同酶酶解小北極海參時(shí),蛋白回收率沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。

    當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至12 h時(shí),7種海參的蛋白回收率為28.56%~98.40%。采用復(fù)合蛋白酶酶解大北極海參時(shí),蛋白回收率最高。3種蛋白酶酶解效率從高到低依次是:復(fù)合蛋白酶>木瓜蛋白酶>風(fēng)味蛋白酶。采用3種不同酶酶解小北極海參時(shí),蛋白回收率沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。

    2.2.3 7種海參提取物得率、蛋白回收率聚類分析 以海參提取物得率和蛋白回收率為指標(biāo),對(duì)不同酶解條件下所制得的63種海參提取物進(jìn)行了聚類分析,一共分為5類,結(jié)果表明:(1)土耳其海參、大連大烏參、澳洲海參、葉瓜參和大北極海參提取物得率及蛋白回收率高,較易酶解;(2)使用復(fù)合蛋白酶所制備的海參提取物得率和蛋白回收率最高,其次是木瓜蛋白酶,最次是風(fēng)味蛋白酶;(3)使用復(fù)合蛋白酶酶解澳洲海參和葉瓜參時(shí),增加酶解時(shí)間有利于蛋白肽的提取。對(duì)于土耳其海參、大連大烏參和大北極海參,使用復(fù)合蛋白酶酶解時(shí),增加酶解時(shí)間不會(huì)顯著提高其提取物得率與蛋白回收率;(4)對(duì)于土耳其參、大連大烏參、澳洲海參和花刺參,使用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解時(shí),增加酶解時(shí)間有利于蛋白肽的提取。而對(duì)于葉瓜參、小北極海參和大北極海參,增加酶解時(shí)間不會(huì)顯著提高其提取物得率和蛋白回收率;(5)對(duì)于葉瓜參和大北極海參,增加酶解時(shí)間有利于蛋白肽的提取。而對(duì)于土耳其參、大連大烏參、澳洲海參、花刺參和小北極海參,使用風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解,延長(zhǎng)酶解時(shí)間不會(huì)顯著提高其提取物得率和蛋白回收率。

    2.3 不同酶、酶解時(shí)間對(duì)7種海參提取物抗氧化活性的影響

    2.3.1 不同酶、酶解時(shí)間對(duì)7種海參提取物還原力的影響 7種海參的還原力值如圖3所示。不同海參經(jīng)3種蛋白酶解,所得提取物的還原力值具有顯著性差異(P<0.05)??偟恼f(shuō)來(lái),土耳其參、大連大烏參和澳洲海參提取物的還原力值相對(duì)較高,其余種海參提取物還原力值較低。

    圖3 酶解4,8,12 h時(shí)7種海參提取物的還原力值Fig.3 Reducing power values of 7 kinds of sea cucumbers in enzymolysis for 4,8,12 h

    具體說(shuō)來(lái),當(dāng)采用木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶以及風(fēng)味蛋白酶酶解不同海參4 h時(shí),7種海參提取物的還原力值為3.34~13.86 μmol trolox當(dāng)量/g干海參,其中,風(fēng)味蛋白酶酶解澳洲海參所得提取物的還原力值最高,達(dá)到13.86 μmol trolox當(dāng)量/g干海參。當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至8 h時(shí),7種海參提取物的還原力值為2.91~13.47 μmol trolox當(dāng)量/g干海參,其中,風(fēng)味蛋白酶酶解土耳其海參所得提取物的還原力值最高,達(dá)到13.47 μmol trolox當(dāng)量/g干海參。當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至12 h時(shí),7種海參提取物的還原力值為4.21~15.98 μmol trolox當(dāng)量/g干海參,其中,風(fēng)味蛋白酶酶解澳洲海參所得提取物的還原力值最高,達(dá)到15.98 μmol trolox當(dāng)量/g干海參。

    2.3.2 不同酶、酶解時(shí)間對(duì)7種海參提取物羥自由基清除能力的影響 7種海參提取物的OH值如圖4所示。不同海參經(jīng)3種蛋白酶解,所得提取物的OH值具有顯著性差異(P<0.05)??傮w來(lái)說(shuō),葉瓜參提取物的OH值最高,明顯高于其他6種海參提取物。土耳其參、大連大烏參和澳洲海參提取物的OH值相對(duì)較低。

    具體來(lái)說(shuō):采用3種酶酶解4 h時(shí),7種海參提取物的OH值為17.39~99.06 μmol trolox當(dāng)量/g干海參,其中,木瓜蛋白酶酶解葉瓜參所得提取物OH值最高,達(dá)到99.06 μmol trolox當(dāng)量/g干海參。當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至8 h時(shí),7種海參提取物的OH值為25.42~128.8 μmol trolox當(dāng)量/g干海參,其中,風(fēng)味蛋白酶酶解葉瓜參所得提取物OH值最高,達(dá)到128.8 μmol trolox當(dāng)量/g干海參。當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至12 h時(shí),OH值變化范圍為27.29~148.43 μmol trolox 當(dāng)量/g 干海參,其中,風(fēng)味蛋白酶酶解葉瓜參所得提取物OH值最高,達(dá)到148.43 μmol trolox當(dāng)量/g干海參。結(jié)果顯示,延長(zhǎng)酶解時(shí)間有利于海參提取物羥自由基清除能力的提高。

    2.3.3 不同酶、酶解時(shí)間對(duì)7種海參提取物氧自由基吸收能力的影響

    圖4 酶解4,8,12 h時(shí)7種海參提取物的OH值Fig.4 OH values of seven kinds of sea cucumbers in enzymolysis for 4,8,12 h

    7種海參提取物的ORAC值如圖5所示。不同海參經(jīng)3種蛋白酶解,所得提取物的ORAC值具有顯著性差異(P<0.05)。與其它海參提取物相比,花刺參提取物的ORAC值較低。采用復(fù)合蛋白酶所制備的海參提取物的氧自由基吸收能力最強(qiáng),其次是木瓜蛋白酶,再次是風(fēng)味蛋白酶。

    圖5 酶解4,8,12 h時(shí)7種海參提取物的ORAC值Fig.5 ORAC values of 7 kinds of sea cucumbers in enzymolysis for 4,8,12 h

    結(jié)果顯示:當(dāng)采用木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶以及風(fēng)味蛋白酶酶解不同海參4 h時(shí),7種海參提取物的 ORAC值為 15.4~99.93 μmol trolox當(dāng)量/g干海參,其中復(fù)合蛋白酶酶解土耳其參所得提取物ORAC值最高,達(dá)到99.93 μmol Trolox當(dāng)量/g干海參。當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至8 h時(shí),7種海參提取物的ORAC值為24.2~133.08 μmol trolox當(dāng)量/g干海參,相對(duì)于酶解4 h所得海參提取物的ORAC值有顯著提高(P<0.05),其中,復(fù)合蛋白酶酶解葉瓜參所得提取物ORAC值最高,達(dá)到133.08 μmol trolox當(dāng)量/g干海參。當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至12 h時(shí),7種海參提取物的ORAC值為19.99~110.2 μmol trolox當(dāng)量/g干海參,相對(duì)于酶解8 h所得海參提取物的ORAC值有顯著降低(P<0.05),其中,復(fù)合蛋白酶酶解土耳其參所得提取物ORAC值最高,達(dá)到110.2 μmol trolox當(dāng)量/g干海參。因此,適當(dāng)延長(zhǎng)酶解時(shí)間有利于海參提取物氧自由基吸收能力的提高,但酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)降低海參提取物氧自由基吸收能力。

    2.3.4 7種海參提取物抗氧化活性聚類分析 以還原力值、ORAC值、OH值為指標(biāo),對(duì)不同酶解條件下所制得的63種海參提取物進(jìn)行了聚類分析,可以分為7類。結(jié)果顯示:(1)葉瓜參提取物的抗氧化能力最強(qiáng),小北極海參提取物次之,其余海參較差;(2)使用復(fù)合蛋白酶所制備的海參提取物抗氧化活性最高,其次是木瓜蛋白酶,最次是風(fēng)味蛋白酶;(3)隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),葉瓜參、花刺參、大/小北極海參提取物的抗氧化活性均有所提高;而土耳其海參、大連大烏參和澳洲海參提取物的抗氧化活性隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)變化不大。

    3 結(jié)論

    本文以7種常見(jiàn)的低值可食用海參為研究對(duì)象,采用3種蛋白酶:復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶,分別水解4,8,12 h,制備得到海參提取物,評(píng)價(jià)其抗氧化活性,結(jié)果表明:

    (1)使用復(fù)合蛋白酶所制備的海參提取物得率、蛋白回收率最高,其次是木瓜蛋白酶,最次是風(fēng)味蛋白酶;7種海參提取物得率為41.24%~55.57%,蛋白回收率為65.06%~98.4%。

    (2)使用復(fù)合蛋白酶所制備的海參提取物抗氧化活性最強(qiáng),其次是木瓜蛋白酶,最次是風(fēng)味蛋白酶;7種海參提取物還原力值為3.41~8.34 μmol trolox當(dāng)量/g干海參,OH值為 28.83~96.65 μmol trolox當(dāng)量/g干海參,ORAC值為 38.99~133.08 μmol trolox當(dāng)量/g干海參;葉瓜參提取物的抗氧化活性最強(qiáng),小北極海參提取物次之,其余海參提取物較差。

    (3)土耳其海參、大連大烏參、澳洲海參、葉瓜參和大北極海參提取物得率及蛋白回收率高,較易酶解;葉瓜參提取物的抗氧化活性最強(qiáng),可作為具有強(qiáng)抗氧化活性的食品配料應(yīng)用于功能性食品。

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