海豹油精制及酯化過程中品質和揮發(fā)性物質變化規(guī)律的研究

鄭振霄 戴志遠 * 彭 茜 張蒙娜 沈 清

（1浙江工商大學海洋食品研究院 杭州 310012

2浙江工商大學 浙江省水產(chǎn)品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室 杭州 310012

3大連工業(yè)大學 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 遼寧大連116034）

海豹（Phoca hispida）是一種生活在高寒地帶的四腳哺乳動物。海豹油是從海豹脂肪組織中提取的常溫下呈淡黃色液體的脂肪油，它是二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）和二十二碳五烯酸（DPA）等ω-3多不飽和脂肪酸（PUFA）的重要來源，富含多種對人體有利的功能因子[1-2]。近年來的研究表明，ω-3PUFA在促進大腦及神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育，降低心血管疾病的發(fā)生等方面起到特殊的功效，可增強人體免疫力，預防癌癥的發(fā)生[3-4]。由于其地緣及相關法律限制的原因，海豹及其副產(chǎn)物起初只是少數(shù)特殊科學研究的對象。近年來，過度的保護導致其超量繁殖，并且海豹與鱈魚的主要膳食中都包括毛鱗魚，海豹的大量繁殖導致鱈魚的膳食來源不斷減少，進而導致鱈魚資源的大量衰減。正是由于這樣的原因，一些國家提出有計劃捕殺海豹的計劃，海豹及海豹油的相關研究逐漸進入人們的視野。

魚油含ω-3多不飽和脂肪酸的同時也含有一定量的膽固醇，而海豹等海洋哺乳動物的油脂雖富含多不飽和脂肪酸、維生素E、角鯊烯，但不含膽固醇[5]。海豹油與魚油的另一個不同點是：海豹油除提供的ω-3多不飽和脂肪酸除EPA、DHA外，還含有母乳的重要成分DPA（增效因子），其含量一般大于3%。而魚油中除了EPA與DHA外，幾乎不含DPA。許多研究證明，DPA在保持動脈血管壁柔軟，抑制血管內皮生長因子（VEGF）引發(fā)的腫瘤，抑制血小板凝聚等方面具有獨特功效[6-7]。用海豹油制成的ω-3 PUFA產(chǎn)品在預防和治療心血管疾病、糖尿病方面比魚油產(chǎn)品更有效[8]。

原油在提取過程中不可避免引入一些非油脂成分，如磷脂、色素及蛋白等。這些非油成分能夠破壞油脂的穩(wěn)定性，影響油的感官性狀，同時也會妨礙后期的精煉及精深加工。對原油進行精煉，對保持油脂的品質及后續(xù)的精深加工都有重要意義。原油一般顏色較深，粘稠，并伴有濃重的腥臭味。對原油首先進行脫膠處理，以除去其中的膠溶性雜質，再經(jīng)脫酸處理除去油脂中的游離脂肪酸，然后利用某些吸附能力強的表面活性物質去除油脂中的色素和雜質，最后經(jīng)脫臭工藝去除油脂中的不良氣味，得到精制油。毛油精煉后，品質大幅度上升。精制油中的ω-3 PUFA含量通常較低，不能夠滿足人們的需求，要對其中的ω-3多不飽和脂肪酸進行富集，才能作為保健品及藥品的原料。然而，甘油三酯結構中的脂肪酸通常是具有異質性的[9]，并具有較高的沸點，這些性質決定直接用甘油三酯來富集是很困難的。通常將甘油酯乙酯化后再富集。甘油三酯乙酯化后，結構中只連接一種脂肪酸且沸點降低，更易分離。乙酯化的方法通常有酸催化法，堿催化法及酶催化法[10]，酸催化法作為一種操作簡單、經(jīng)濟實惠的方法被廣泛應用于油脂加工企業(yè)。

精制和乙酯化作為功能油脂生產(chǎn)不可或缺的工序，對產(chǎn)品的品質具有重要的影響。研究精制和酯化對海豹油品質及揮發(fā)性物質的影響，對于功能性油脂的生產(chǎn)意義重大。張建友等[11]研究了精制對魚油品質的影響，發(fā)現(xiàn)精制可以顯著降低魚油的酸值和過氧化值，提高魚油的碘值，而對魚油中EPA和DHA的含量影響不大；劉書成等[12]研究了精煉工藝對金槍魚油脂肪酸組成的影響，結果表明：精制可以提升魚油的品質，而對其脂肪酸組成影響不大；張紅燕等[13]研究了脫臭工藝對金槍魚油品質及揮發(fā)性物質的影響，指出脫臭工藝可顯著減少魚油中揮發(fā)性物質的種類和數(shù)量，并且溫度越高，效果越明顯。雖然許多學者對油脂加工過程中品質的變化進行了研究，但以海豹油為對象，全面分析其在精制及酯化過程中的品質及揮發(fā)性物質變化規(guī)律還鮮見報道。本文以海豹油毛油為原料，研究精制及酯化過程中海豹油品質及脂肪酸組成的變化，通過GC-MS分析海豹油揮發(fā)性物質的變化，為功能性海豹油的生產(chǎn)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海豹油毛油由舟山市奧旭魚油有限公司提供；活性土購于黃山市白岳活性白土有限公司；37種脂肪酸混標購于上海安普科學儀器有限公司；其它試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）涂層萃取頭，美國Supelco公司；7890B氣相色譜儀，美國Agilent公司；Trace GC Ultra氣相色譜與DSQⅡ質譜聯(lián)用儀，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 海豹油的精煉

海豹油的脫膠、脫酸、脫色及脫臭工藝參考張建友[11]的方法。

1.4 海豹油的乙酯化

海豹油的乙酯工藝如下[10]：海豹油→加入定量的無水乙醇→加入定量的濃硫酸→無水硫酸鈉脫水→恒溫反應→轉移到分液漏斗→水洗至中性→靜置分層→乙酯油

1.5 理化指標的測定

水分及揮發(fā)物：參照GB/T5528-2008動植物油脂水分及揮發(fā)物含量的測定方法測定；酸價：參照GB/T5530-2005動植物油脂酸價和酸度的測定方法來測定；皂化值：參照GB/T5534-2008動植物油脂皂化值的測定方法來測定；過氧化值：參照GB/T5538-2005動植物油脂過氧化值的測定方法測定；碘值：參照GB/T5532-2008動植物油脂碘值的測定方法來測定。

1.6 脂肪酸組成測定

海豹油甘油酯的甲酯化：稱取100 mg脫色魚油于具塞試管中，加入2 mL 0.5 mol/L的NaOHCH3OH溶液，充分搖勻，65℃水浴加熱30 min，取出后自然冷卻，再加入2 mL 15%BF3-CH3OH溶液，充分搖勻，65℃水浴加熱3 min，取出后自然冷卻，然后加入2 mL正己烷提取，靜止分層，取上層清液并加入少量無水Na2SO4，過有機相濾膜后用氣相色譜儀進行脂肪酸相對含量測定[14-15]。

海豹油乙酯的甲酯化：取脂肪酸乙酯30～100 mg，于具塞試管中，加入2 mL 15%BF3-CH3OH溶液，充分搖勻，65℃水浴加熱3 min，取出后自然冷卻，然后加入2 mL正己烷提取，靜置分層，取上層清液并加入少量無水Na2SO4，過有機相濾膜后用氣相色譜儀進行脂肪酸相對含量測定[16]。

GC檢測條件：HP-88氰丙基色譜柱（30 m×0.25 mm，0.20 μm）；載氣：H2；不分流進樣；進樣量1 μL；檢測溫度220℃；程序升溫：起始柱溫設定為70℃，以15℃/min升至 120℃，保持 1 min，再以5℃/min升至175℃，保持10 min；最后以5℃/min升至220℃，保持5 min。

1.7 揮發(fā)性物質的測定[17]

SPME：稱取5 g樣品置于15 mL頂空進樣瓶中，60℃下平衡10 min，并將老化好的50/30μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）涂層萃取頭插入進樣瓶頂空部分，60℃下吸附30 min，取出后插入GC進樣口，250℃解吸3 min。

GC條件：色譜柱為TR-35 MS（30 m ×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氦氣；進樣口溫度 250℃，不分流進樣；升溫程序：初始溫度40℃，保持3 min，以5℃/min升至90℃，再以10℃/min升至230℃，保持 7 min。

MS條件：離子源溫度200℃；電子離子源（EI）；電子能量70 eV；傳輸線溫度250℃；檢測器溫度280℃；質量掃描范圍m/z 30～500。

1.8 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)定性分析時，通過NIST 2.0譜庫做自動檢索確認定性，且僅當正反匹配度（SI/RSI）均大于800（最大值為1 000）的鑒定結果才予以保留。定量分析時采用峰面積歸一化法求得各揮發(fā)性成分相對百分含量。

相關測定數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示。采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件包對各組數(shù)據(jù)進行顯性分析，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 理化指標

海豹油原油、精制油及酯化油的理化指標如表1所示。原油中的水分及揮發(fā)性物質的含量為1.65%，顯著高于精制油（0.49%）和酯化油（0.48%），而精制油和酯化油中的水分及揮發(fā)性物質的含量差異不顯著。水分及揮發(fā)性物質主要包括油脂中的水分及一些沸點較低的物質，這些物質的存在對油的品質會產(chǎn)生不良影響。Cozzolinoa等[18]的研究表明油脂中的水分及揮發(fā)性物質會和溫度、光照強度及增強劑等單獨或協(xié)同作用加速油脂的酸??；孫麗琴等[19]的研究表明油脂中水分及揮發(fā)性物質的含量與油脂中的微生物及酶的活動相關，含量越高，油脂的品質越差。酸價是衡量油脂中游離脂肪酸（FFA）含量的指標。油脂中存在一定量的FFA，F(xiàn)FA的存在會使海豹油帶有刺激性氣味從而影響海豹油的整體質量，更重要的是FFA比甘油酯中的脂肪酸更容易發(fā)生氧化酸敗，此外高含量的FFA會導致皂的形成，這對于此后甘油和酯的分離帶來很大的困難[20-21]。原油、精制油及酯化油的酸價分別為 3.11 mg KOH/g、0.63 mg KOH/g和0.84 mg KOH/g，原油的酸價明顯高于精制油和酯化油，精制油和酯化油的酸價遠低于華盛頓營養(yǎng)委員會（CRN）規(guī)定的功能性油脂質量標準中的限定值（＜3 mg KOH/g），這說明精制可以顯著降低海豹油的酸價，提升原油的品質。皂化值表示在規(guī)定條件下，中和并皂化1 g樣品所消耗的氫氧化鉀的毫克數(shù)，皂化值是反映油脂純度及脂肪酸分子質量大小的重要指標[22]。從表1中可以看出原油的皂化值（165.69 mg KOH/g）低于精制油（181.48 mg KOH/g）和酯化油（177.73 mg KOH/g），而精制油和酯化油的皂化值沒有顯著差別，這說明精制可以顯著降低海豹油的皂化值，減少原油中的不皂化雜質的含量，而乙酯化對海豹油皂化值的影響不顯著。油脂過氧化物值是判斷油脂及其制品氧化程度的重要指標，主要反映油脂中氫過氧化物的含量，是評價油脂品質的重要依據(jù)。從表1中可以看出，原油、精制油和酯化油的過氧化物值沒有顯著差別，這說明在處理過程中油脂發(fā)生氧化的程度較低，原因可能是整個反應過程是處于高度真空或者是充氮的條件下進行的，氧氣含量很低，因此油脂發(fā)生氧化的程度不明顯。碘值反映油脂不飽和程度，從表1可以看出，精制油（117.27 g I2/100g）和酯化油（116.63 g I2/100g）的碘值要明顯高于原油（110.79 g I2/100g）。這說明在精制過程中，海豹油中的雜質不斷被去除，使得海豹油的不飽和程度得到提高[10]。

2.2 脂肪酸組成

海產(chǎn)哺乳動物油脂的最大的特點就是富含單不飽和脂肪酸（MUFA）和ω-3 PUFA，飽和脂肪酸相對較少。海洋哺乳動物的脂肪酸組成與魚類相似，但比例差距很大，海豹等海產(chǎn)哺乳動物油脂中的MUFA組成通常在40%以上，而魚油中的MUFA通常在20%左右，此外海豹油中還含有魚油中幾乎沒有的特殊脂肪酸-DPA。海豹油中常見的飽和脂肪酸有 C12∶0、C14∶0、C16∶0和C18∶0，通?？梢詸z測到 少 量 C20：0，有時會檢測到微量的C22∶0和C24∶0[23-26]。海豹油原油、精制油及酯化油的脂肪酸組成如表2所示。從表2中可以看出，原油，精制油及酯化油中均檢測到了6種飽和脂肪酸，它們分別是 C12∶0、C14∶0、C16∶0、C18∶0和C20∶0。飽和脂肪酸中C16∶0含量最高，質量分數(shù)分別為9.37%，9.06%和13.41%，其次是 C14∶0，分別占到 4.71%，4.46%和6.49%。原油，精制油和酯化油中均檢測到了6種MUFA，它們分別是 C14∶1，C16∶1，C17∶1，C18∶1trans，C18∶1cis和C20∶1，其中 C18∶1cis含 量最 高，分別 占 到25.75%，20.89%和19.28%，其次是 C16∶1，質量分數(shù)分別為18.17%，15.88%和14.66%。海豹油脂質富含ω-3 PUFA是動物低溫適應的結果，因為在較低溫度下，ω-3 PUFA仍能保持液體狀態(tài)而不會結晶[27]。從表2中可以看出，海豹油中的ω-3 PUFA主要是EPA，DPA和DHA，EPA和DHA的含量較為接近，占到總脂肪酸的7%～8%，而DPA含量相對較低，占總脂肪酸的4%左右，這樣的結果與加拿大學者Shahidi等[26]的報道具有一致性。

表1 海豹油原油、精制油及酯化油的品質指標Table 1 The characterization of the crude，refined and ethyl ester seal oil

海豹油原油、精制油及酯化油中飽和脂肪酸的含量分別為16.72%，16.06%和21.98%。原油和精制油中的飽和脂肪酸含量相差不大，但均低于酯化油中的含量，這說明酯化工藝可以促進飽和脂肪酸含量的上升。海豹油原油、精制油及酯化油中MUFA的含量分別為60.53%，58.56%和53.68%，呈逐漸下降的趨勢。對比表2，C16∶1和C18∶1cis的下降最為明顯，這說明精制和酯化工藝對這兩種脂肪酸含量的影響最大；而對于C18∶1trans，趨勢則相反，原油、精制油和酯化油中的含量分別為5.56%，9.18%和8.94%，這說明精制和酯化會導致其含量的上升。海豹油原油、精制油及酯化油中PUFA的含量分別為22.75%，25.38%和24.34%，相對于原油，精制油和酯化油中的PUFA含量略有上升，這可能是因為原油中的雜質經(jīng)精制脫去后，海豹油中PUFA的質量分數(shù)得到提升的結果。海豹油原油、精制油及酯化油中EPA、DPA和DHA的總含量分別為19.48%，19.58%和19.36%，含量沒有顯著差別，說明精制及酯化處理對海豹油中的EPA、DPA和DHA的含量影響不顯著。

反式脂肪酸與長期困擾人類的重大疾病如冠心病、心肌梗死等心血管疾病有著密切的聯(lián)系。從表2中可以發(fā)現(xiàn) C18∶1trans和C18∶2trans這兩種反式脂肪酸的含量在整個過程都呈現(xiàn)上升趨勢，其中C18∶2trans在原油中沒有檢測到，而出現(xiàn)在精制油及酯化油中，這樣的結果表明，精制及酯化工藝會導致反式脂肪酸含量的上升。油脂在精制加工及酯化過程中，在強酸、強堿及長時間高溫等條件的影響下，不飽和脂肪酸容易從順式結構轉化為能量上更為穩(wěn)定的反式構象，使得反式脂肪酸含量增加。Henon等[28]的研究表明亞麻酸在脫臭階段的異構化現(xiàn)象最為嚴重，張建友[11]也指出油脂在精制及酯化過程中，應控制高溫作用的時間，進而控制產(chǎn)品中反式脂肪酸的含量。

2.3 揮發(fā)性物質

HS-SPME-GC-MS是測定揮發(fā)性物質的一種常用手段，既具有準確性高、選擇性好、鑒別能力強的特點，同時又具有所需樣品少、靈敏度高的特點[29]。許多學者都采取GC-MS的方法對油脂中的揮發(fā)性物質進行了研究。王亞男等[15]利用GC-MS對超臨界萃取得到的金槍魚油中的揮發(fā)性物質進行了研究，發(fā)現(xiàn)魚油中的主要揮發(fā)性物質為酸類、醛類、烴類、酮類及一些雜環(huán)化合物。李文佳等[30]利用GC-MS對淡水魚油中的揮發(fā)性物質進行了測定，分析結果表明醛類是淡水魚油中的主要揮發(fā)性物質，占到總揮發(fā)性物質的45.26%。

表2 海豹油原油、精制油及酯化油的脂肪酸組成（%）Table 2 The fatty acids composition of the crude，refined and ethyl ester seal oil（%）

本試驗采取HS-SPME-GC-MS的方法對海豹油原油、精制油及酯化油中的揮發(fā)性物質的種類和含量進行了測定，并以不同種類物質的峰數(shù)量和峰面積對海豹油中的揮發(fā)性物質進行分析。海豹油中揮發(fā)性物質的種類及數(shù)量如表3所示，海豹油原油、精制油及酯化油中分別測得86，50和44種揮發(fā)性物質，原油中含有的雜質較多，因此從原油中測得的揮發(fā)性物質也最多，精制油和酯化油中揮發(fā)性物質的種類數(shù)相差不大，這樣的結果與本文第一部分中不同海豹油中的水分及揮發(fā)性物質的含量具有較高的一致性。原油中的烴類和醛類物質的種類數(shù)較多，其次是酯類和芳香族化合物，而酸類和酮類的種類數(shù)較少；精制后海豹油中的醛類物質的種類數(shù)減少最多（21降至4），其次是烴類（21 降至 14）和酯類（16 降至 8），這說明精制可以顯著降低海豹油中的醛類物質的數(shù)量；酯化油中的酯類物質最多（24種），其次是烴類（11種），酯化油中的酯類物質明顯增加，這說明酯化工藝導致了許多揮發(fā)性物質由酸或醇等其它的形式轉化為酯。

表3 海豹油原油、精制油及酯化油揮發(fā)性物質的種類及數(shù)量Table 3 The classification and quantity of volatile substances in the crude，refined and ethyl ester seal oil

海豹油原油、精制油及酯化油揮發(fā)性物質的總峰面積分別為83.16%，60.06%和36.19%，這表明隨著精制及酯化工藝的進行，海豹油中的揮發(fā)性物質的含量在不斷減少。張紅燕等[13]研究了精制工藝前后金槍魚油中揮發(fā)性物質的變化，發(fā)現(xiàn)精制可以明顯減少金槍魚油中揮發(fā)性物質的種類和含量。不同種類物質的峰面積如圖1所示。從圖1中可以看出，原油中醛類物質貢獻的峰面積最多，占33.48%，其次是烴類19.66%；精制油中最多的是烴類占16.93%，其次是酯類14.83%；酯化油中酯類物質的峰面積最多為27.00%，其次是烴類。對比可得，精制工藝對海豹油中的醛類物質影響最大，峰面積從33.48%減少到2.00%，這可能是由于醛類物質多數(shù)具有較低的沸點，脫臭環(huán)節(jié)的高溫使多數(shù)醛類物質發(fā)生了轉化；酯化工藝對海豹油中的烴類物質、酯類物質、及一些雜環(huán)含N化合物影響較大，峰面積分別從16.93%降至5.03%，14.83%增加到27.00%，4.75%減少到0.51%。海豹油原油、精制油及酯化油中的揮發(fā)性物質的名稱及含量如表4所示。從表4中可以看出，原油中主要是2，4-庚二烯醛、壬醛、辛醛、己醛及庚醛等物質賦予海豹油原油以油脂氣息、魚腥味、泥土味、脂肪香味、青草香味、蠟香味等。精制油及酯化油中的揮發(fā)性物質含量及數(shù)量大大減少，只是少量烯醇類和酯類貢獻的魚腥味、油脂氣息及蔬菜香味等。

圖1 海豹油原油、精制油及酯化油中揮發(fā)性物質的相對含量（%）Fig.1 Relative content of volatile compounds in the crude，refined and ethyl ester seal oil（%）

表4 海豹油原油、精制油及酯化油中的揮發(fā)性物質種類及含量（%）Table 4 The classification and relative content of volatile substances in the crude，refined and ethyl ester seal oil（%）

（續(xù)表4）

（續(xù)表4）

（續(xù)表4）

3 結論

精制可以顯著地（P<0.05）降低海豹油中的水分及揮發(fā)性物質的含量和酸價，分別由1.65%降低到 0.49%，3.11 mg KOH/g降低至 0.63 mg KOH/g，而乙酯化對其影響較??；精制可以顯著提高海豹油的皂化值及碘值，分別從165.69 mg KOH/g 提高到 181.48 mg KOH/g，110.79 g I2/100g提高到117.27g I2/100 g，這說明在精制過程中，海豹油中的不皂化物等雜質不斷被去除，使得海豹油的純度得到提高；海豹油原油、精制油及酯化油中的過氧化物值分別為4.42，4.31和4.23 meq/kg，表明精制及酯化工藝過氧化物值的含量影響不顯著。

海豹油原油、精制油及酯化油中的MUFA含量最高，分別占到60.53%，58.56%和53.68%，其次是PUFA，含量分別為22.75%，25.38%和24.34%，SFA含量最少為16.72%，16.06%和21.98%；對比可得，精制及酯化處理過程中MUFA含量呈下降趨勢，而SFA含量總體有所上升；海豹油原油、精制油及酯化油中的EPA、DPA和DHA的總含量分別為19.48%，19.58%和19.36%，表明精制及酯化工藝對海豹油中的EPA、DPA和DHA的含量影響較小。

海豹油原油、精制油及酯化油中分別檢測出了86，50和44種揮發(fā)性物質，揮發(fā)性物質的總峰面積分別為83.16%，60.06%和36.19%，這說明精制工藝可以顯著降低對海豹油中的揮發(fā)性物質的種類和含量，而酯化工藝可以顯著降低海豹油中揮發(fā)性物質的含量；海豹油原油中的主要揮發(fā)性物質為醛類（21種，33.48%），精制后的主要揮發(fā)性物質為烴類（14種，16.93%）和酯類（8種，14.83%），酯化油的主要揮發(fā)性物質為酯類（24種，27.00%），表明原油經(jīng)過精制工藝，其中低沸點的醛類物質被降解，轉化為酸類物質，而酸類物質在酯化階段最終被轉化為更為穩(wěn)定的酯類。