不同品種大豆分離蛋白體外消化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特性

江連洲 胡繼瑩 張瀟元 張菀坤 李 楊 齊寶坤 劉 爽 潘 悅米 思 董苗苗 王中江

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱 150030）

大豆是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)及油料作物之一，是人類生存不可或缺的重要食物來源[1]。根據(jù)栽培區(qū)域不同，我國(guó)大豆主要?jiǎng)澐譃?個(gè)大區(qū)種，即北方春大豆栽培區(qū)、黃淮流域夏大豆栽培區(qū)及南方大豆栽培區(qū)[2]。根據(jù)大豆生產(chǎn)用途又將其劃分為三大品種，即高蛋白大豆、高油品種、雙高大豆[3]。大豆蛋白各組分含量和比例、氨基酸組成、亞基組成及空間構(gòu)象隨大豆品種和產(chǎn)地的不同而有所不同，這種差異顯著影響大豆蛋白的功能特性。

近年來關(guān)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究逐漸深入，對(duì)不同品種大豆分離蛋白（SPI）紅外光譜酰胺I帶進(jìn)行分析，結(jié)果表明：品種差異對(duì)大豆分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)4種類型α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的含量影響極顯著[4]。這種差異顯著影響大豆蛋白的生產(chǎn)加工。謝良等[5]對(duì)國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口大豆分離蛋白研究，差示掃描量熱法（DSC）結(jié)果表明國(guó)產(chǎn)大豆熱焓較低，大豆分離蛋白分子質(zhì)量較小。Khatib等[6]采用色氨酸熒光發(fā)射光譜和同步熒光光譜研究不同品種大豆的7S球蛋白和11S球蛋白，得知品種差異引起色氨酸所處微環(huán)境極性不同，反映出三級(jí)結(jié)構(gòu)存在差異。對(duì)不同種類大豆分離蛋白在人體正常消化道條件下的消化吸收差異仍知之甚少[7]，阻礙了大豆蛋白構(gòu)象的定性及定量分析。

本研究通過模擬人體胃部消化環(huán)境，探討體外模擬消化過程中不同品種大豆分離蛋白及空間構(gòu)象與大豆分離蛋白消化程度的構(gòu)效關(guān)系，為我國(guó)大豆蛋白實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白，實(shí)驗(yàn)室自制；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；正己烷，天津北科化學(xué)品有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TD5M-WS 臺(tái)式大容量離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；MAGNA-IR560傅里葉變換紅外光譜系統(tǒng)，美國(guó)貝克曼公司；PerkinElmer Raman Station 400拉曼光譜儀，美國(guó)貝克曼公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大豆分離蛋白的熱處理 參考王中江等[8]的方法，將適量不同品種大豆分離蛋白分散于蒸餾水中配制成5%的大豆蛋白溶液，并取調(diào)配后樣品溶液100 mL，分別密封于加熱套管中，并在85℃控溫水浴鍋進(jìn)行15 min預(yù)熱處理，經(jīng)熱處理完成后，迅速放入冰水浴降溫待用。

1.3.2 大豆分離蛋白消化產(chǎn)物水解度的測(cè)定 采用鄰苯二甲醛法對(duì)大豆蛋白消化過程的水解度（DH）的測(cè)定，用可見光分光光度計(jì)在340 nm下測(cè)定其吸光度。

水解度的計(jì)算：

式中：htot取決于原料的類型，H表示絲氨酸氨基毫摩數(shù)的函數(shù)，Serine NH2表示毫摩Serine NH2/g蛋白，X表示樣品質(zhì)量，P表示樣品中的蛋白含量，0.1表示樣品體積轉(zhuǎn)換成L，α、β見表1[9]。

1.3.3 傅里葉紅外光譜（FT-IR）的測(cè)定 參考張忠慧[10-12]的方法。將凍干樣品充分干燥后，取樣品1～2 mg與100 mg溴化鉀混勻、研磨、壓片，測(cè)定FT-IR。測(cè)定在波數(shù)范圍為 4 000～400 cm-1的吸收光譜，分辨率4 cm-1，波數(shù)精度0.01 cm-1，掃描次數(shù)64次，環(huán)境溫度25℃。

1.3.4 拉曼光譜的測(cè)定 參考張萍[13]的方法。掃描波長(zhǎng)785 nm，功率為300 mW，掃描范圍400～2 000 cm-1，掃描時(shí)間每次 60 s，積分 10 次，4次掃描進(jìn)行累加。以苯丙氨酸（1 003±1 cm-1）作為歸一化因子，得到大豆分離蛋白的拉曼光譜。

表1 不同來源蛋白質(zhì)的α、β及htot值Table 1 Different sources of protein of α，β and htotvalues

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 每次試驗(yàn)做3次平行，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異顯著性采用t檢驗(yàn)分析（P<0.05）。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0軟件，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin 9.1軟件、PeakFit 4.12軟件分析等進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，圖表處理及圖譜分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆分離蛋白體外模擬消化過程中的DH分析

5種不同品種的大豆分離蛋白經(jīng)過連續(xù)5 h的體外模擬消化試驗(yàn)，不同樣品在消化過程中不同消化時(shí)間的DH測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2 不同消化時(shí)間對(duì)大豆分離蛋白DH的影響Table 2 Effects of DH in vitro digestion at different digestion time

由表2可知，不同品種大豆分離蛋白在消化過程中，水解度DH隨著消化時(shí)間延長(zhǎng)，均呈增加趨勢(shì)，經(jīng)1h消化反應(yīng)，DH增加速度減慢，不同樣品DH存在差異性。樣品C在不同消化時(shí)間的DH基本保持最低水平，而樣品E的DH在反應(yīng)開始0.5 h內(nèi)消化水解的程度較大，樣品A的DH在整個(gè)消化過程中一直保持較高的消化水平，其余樣品的DH居中呈波動(dòng)式變化趨勢(shì)。

2.2 不同品種大豆分離蛋白體外消化過程中的紅外光譜分析

2.2.1 東農(nóng)46號(hào)（A）及消化產(chǎn)物的紅外光譜分析

由圖1可知，大豆分離蛋白及其消化產(chǎn)物在波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1的吸收光譜，其中在酰胺I帶1 700～1 600 cm-1有較強(qiáng)吸收。指認(rèn)擬合圖譜中各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)關(guān)系為：1 650～1 660 cm-1為 α-螺旋結(jié)構(gòu)[14]；1 618～1 640 cm-1和1 670～1 690 cm-1為 β-折疊結(jié)構(gòu)[15]；1 640～1 650 cm-1為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)[14]；1 660～1 700 cm-1為 β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)[15-16]。通過計(jì)算各子峰積分面積得到二級(jí)結(jié)構(gòu)4種類型的相對(duì)百分含量及水解度曲線DH見圖2。經(jīng)過連續(xù)5 h的消化試驗(yàn)，從樣品A大豆分離蛋白的紅外光譜擬合計(jì)算出的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化結(jié)果可以看出，二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊、β-轉(zhuǎn)角呈逐漸下降的趨勢(shì)，而無規(guī)則卷曲含量隨消化時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加，α-螺旋變化先增加后減少。在β-折疊結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步分析可知，平行式的β-折疊結(jié)構(gòu)與反平行式β-折疊結(jié)構(gòu)變化趨勢(shì)相反，平行式的β-折疊結(jié)構(gòu)逐漸減少向反平行式的β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換。

圖1 不同消化時(shí)間樣品A及消化產(chǎn)物的FT-IR譜圖Fig.1 FT-IR spectrum of digestion products of SPI-A with different digestion time

圖2 不同消化時(shí)間SPI-A及消化產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 The secondary structures of digestion products of SPI-A with different digestion time

2.2.2 菏豆21號(hào)（B）及消化產(chǎn)物的紅外光譜分析

經(jīng)過連續(xù)5 h的消化試驗(yàn)，從樣品B大豆分離蛋白的紅外光譜擬合計(jì)算出的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化結(jié)果可以看出，二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊呈逐漸下降的趨勢(shì)，β-轉(zhuǎn)角含量總體上看也呈下降趨勢(shì)，而無規(guī)則卷曲含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)仍不斷增加，α-螺旋變化不規(guī)律，略增加后減少。在β-折疊結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步分析可知，平行式的β-折疊結(jié)構(gòu)與反平行式β-折疊結(jié)構(gòu)變化趨勢(shì)相反，平行式的β-折疊結(jié)構(gòu)逐漸減少向反平行式的β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換。

圖3 不同消化時(shí)間樣品B及消化產(chǎn)物的FT-IR譜圖Fig.3 FT-IR spectrum of digestion products of SPI-B with different digestion time

圖4 不同消化時(shí)間樣品B及消化產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 The secondary structures of digestion products of SPI-B with different digestion time

圖5 不同消化時(shí)間樣品C及消化產(chǎn)物的FT-IR譜圖Fig.5 FT-IR Spectrum of digestion products of SPI-C with different digestion time

2.2.3 陜豆125號(hào)（C）的紅外光譜分析 經(jīng)過連續(xù)5 h的消化試驗(yàn)，從樣品C大豆分離蛋白的紅外光譜擬合計(jì)算出的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化結(jié)果可以看出，二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量總體上看呈下降趨勢(shì)，而無規(guī)則卷曲含量隨消化時(shí)間的延長(zhǎng)仍不斷增加后略有減少，α-螺旋含量變化不規(guī)律總體上看呈增加趨勢(shì)。在β-折疊結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步分析可知，隨著β-折疊結(jié)構(gòu)總體含量的下降，平行式的β-折疊結(jié)構(gòu)與反平行式β-折疊結(jié)構(gòu)呈相反的變化趨勢(shì)，平行式的β-折疊結(jié)構(gòu)逐漸減少向反平行式的β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換。

2.2.4 滇豆4號(hào)（D）的紅外光譜分析 經(jīng)過連續(xù)5 h的消化試驗(yàn)，從樣品D大豆分離蛋白的紅外光譜擬合計(jì)算出的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化結(jié)果可以看出，二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量總體上看呈下降趨勢(shì)，而二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲的含量隨消化時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈增加趨勢(shì)，α-螺旋含量變化不規(guī)律。在β-折疊結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步分析可知，隨著β-折疊結(jié)構(gòu)總體含量的下降，平行式的β-折疊結(jié)構(gòu)含量不斷減少，而反平行式β-折疊結(jié)構(gòu)含量變化不大，略有增加。

圖6 不同消化時(shí)間樣品C及消化產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 The secondary structures of digestion products of SPI-C with different digestion time

圖7 不同消化時(shí)間樣品D及消化產(chǎn)物的FT-IR譜圖Fig.7 FT-IR spectrum of digestion products of SPI-D with different digestion time

圖8 不同消化時(shí)間樣品D及消化產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.8 The secondary structures of digestion products of SPI-D with different digestion time

2.2.5 冀豆15號(hào)（E）的紅外光譜分析 經(jīng)過連續(xù)5 h的消化試驗(yàn)，從樣品E大豆分離蛋白的紅外光譜擬合計(jì)算出的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化結(jié)果可以看出，二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量總體上看呈下降趨勢(shì)，而無規(guī)則卷曲的含量隨消化時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈增加趨勢(shì)，α-螺旋含量變化呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)。對(duì)β-折疊結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步分析可知，隨著β-折疊結(jié)構(gòu)總體含量的下降，平行式的β-折疊結(jié)構(gòu)含量不斷減少，而反平行式β-折疊結(jié)構(gòu)含量變化不大，略有增加。

圖9 不同消化時(shí)間樣品E及消化產(chǎn)物的FT-IR譜圖Fig.9 FT-IR spectrum of digestion products of SPI-E with different digestion time

圖10 不同消化時(shí)間樣品E及消化產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.10 The secondary structures of digestion products of SPI-E with different digestion time

本部分研究主要以5種樣品在連續(xù)5 h的消化過程中，大豆分離蛋白的紅外光譜擬合計(jì)算出的二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊結(jié)構(gòu)含量變化為考察指標(biāo)。SPI-A的β-折疊結(jié)構(gòu)含量較高，但α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量較低；SPI-B無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的含量最高而α-螺旋含量最低；SPI-C的β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的含量最高，但無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的含量最低。在本研究中，隨著消化反應(yīng)的不斷進(jìn)行，5個(gè)SPI樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的含量有所下降。分析原因可能為，SPI樣品中β-折疊總含量的降低可以歸因于平行β-折疊的消化酶解，而反平行β-折疊量略有增加。在連續(xù)5 h的消化過程后，SPIA和SPI-B的α-螺旋比例含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，而SPI-D和SPI-E普遍呈先下降后上升的趨勢(shì)，但SPI-C的α-螺旋結(jié)構(gòu)百分比呈上升趨勢(shì)。SPI中α-螺旋結(jié)構(gòu)比例降低有可能是α-螺旋被消化酶解。SPI-A和SPI-B中的α-螺旋的含量在0.5～1 h不斷下降，而在0～0.5h，SPI-D和SPIE中的α-螺旋的含量也降低，表明α-螺旋的消化水解反應(yīng)發(fā)生在反應(yīng)的初期。

隨著消化反應(yīng)的不斷進(jìn)行，SPI-A、SPI-D和SPI-E中的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的百分比普遍增加，SPI-B的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的百分比先下降后上升，SPI-C的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)比例先升高后下降，分析推知α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)的消化可能增加無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的含量。因此，研究幾乎不能確定SPIA，SPI-D和SPI-E在消化過程無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的消化規(guī)律，但SPI-B的初始消化階段時(shí)間和SPI-C下前2 h的消化反應(yīng)中無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的含量降低可能與無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的消化降解有關(guān)。

2.2.6 大豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)與DH相關(guān)性分析 由上所述分析可知，大豆蛋白結(jié)構(gòu)展開，使得β-折疊結(jié)構(gòu)在SGF中暴露出更多易感位點(diǎn)，增加了胃蛋白酶與酶切位點(diǎn)結(jié)合的可及性與可能性，而大豆蛋白中的α-螺旋結(jié)構(gòu)的消化發(fā)生初期，只有部分被消化酶解掉，而整個(gè)消化反應(yīng)過程中β-折疊結(jié)構(gòu)幾乎都隨時(shí)間不斷延長(zhǎng)而被消化酶解。在連續(xù)5 h消化反應(yīng)中，大豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)與DH相關(guān)性分析如表3。

表3 二級(jí)結(jié)構(gòu)與DH之間的相關(guān)性Table 3 The correlation analysis between secondary structure and DH

由表3可知，5種大豆分離蛋白經(jīng)過連續(xù)5 h的體外模擬消化后，由于消化反應(yīng)過程的β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)與無規(guī)卷曲變化呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)，在消化反應(yīng)的不同時(shí)間段與DH之間幾乎均未有相關(guān)性，在反應(yīng)進(jìn)行0.5 h的短時(shí)消化酶解，樣品的蛋白質(zhì)中α-螺旋結(jié)構(gòu)與 DH 具有極顯著（P<0.05，r=0.99）的正相關(guān)；而樣品的蛋白質(zhì)中β-折疊結(jié)構(gòu)在長(zhǎng)時(shí)間消化反應(yīng)過程中與DH的相關(guān)性逐漸明顯，在反應(yīng)進(jìn)行5 h后，β-折疊結(jié)構(gòu)與DH呈現(xiàn)出顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05，r=-0.91）這與 Carbonaro 等[17]研究的結(jié)果相一致。由此可以初步推斷，樣品蛋白質(zhì)中α-螺旋結(jié)構(gòu)及β-折疊結(jié)構(gòu)的含量對(duì)大豆蛋白質(zhì)的長(zhǎng)、短時(shí)消化酶解的效果及效率都有著重要影響，而從上述5種樣品連續(xù)5 h消化過程中，二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化分析也可得知，隨著消化反應(yīng)的不斷進(jìn)行，5種樣品的大豆分離蛋白的紅外光譜擬合計(jì)算出的二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量總體上看呈下降趨勢(shì)，α-螺旋含量及無規(guī)則卷曲變化呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)，各結(jié)構(gòu)之間可能存在相互轉(zhuǎn)化。

2.3 不同大豆分離蛋白的拉曼光譜分析

2.3.1 東農(nóng)46號(hào)（A）及消化產(chǎn)物的拉曼光譜分析

樣品A（SPI-A）大豆蛋白及消化產(chǎn)物拉曼光譜如圖11所示，其譜峰的歸屬見表4。

圖11 不同消化時(shí)間樣品A及消化產(chǎn)物的拉曼光譜圖Fig.11 Raman spectra of digestion products of SPI-A with different digestion time

表4 SPI-A消化產(chǎn)物的拉曼光譜及特征頻率歸屬Table 4 Raman spectrum and assignment of characteristic bands of digestion products of SPI-A

1）主鏈構(gòu)象分析 樣品A大豆蛋白消化產(chǎn)物的拉曼光譜的酰胺I帶進(jìn)行定量分析，分析采用Raman Spectral Analysis Package Version 2.1軟件完成，結(jié)果見表5。

由表5可知，在連續(xù)5 h的消化過程中，SPIA及消化產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊含量最高且含量不斷減少，而α-螺旋結(jié)構(gòu)含量呈增加的趨勢(shì)，β-轉(zhuǎn)角含量及無規(guī)則卷曲含量變化不規(guī)律。

2）側(cè)鏈構(gòu)象分析 SPI-A消化產(chǎn)物的色氨酸譜帶相對(duì)強(qiáng)度及酪氨酸費(fèi)米共振線I850/I830分析結(jié)果見表6。

由表6可知，樣品A大豆分離蛋白及不同時(shí)間的消化產(chǎn)物的I850/I830在1.01～1.02之間，其酪氨酸殘基趨向于“暴露式”，5 h的消化過程中，酪氨酸殘基微觀環(huán)境變化較小，在760 cm-1附近區(qū)域的拉曼峰色氨酸譜帶強(qiáng)度在整個(gè)消化反應(yīng)中呈下降趨勢(shì)。

表6 SPI-A消化產(chǎn)物的I850/I830及酪氨酸殘基分析結(jié)果Table 6 I850/I830and tyrosine residues analysis results of digestion products of SPI-A

2.3.2 樣品菏豆21號(hào)（B）的拉曼光譜分析 樣品B（SPI-B）大豆蛋白及消化產(chǎn)物的拉曼光譜如圖12所示，其譜峰的歸屬見表7。

圖12 不同消化時(shí)間樣品B及消化產(chǎn)物的拉曼光譜圖Fig.12 Raman spectra of digestion products of SPI-B with different digestion time

表7 SPI-B消化產(chǎn)物的拉曼光譜及特征頻率歸屬Table 7 Raman spectrum and assignment of characteristic bands of digestion products of SPI-B

1）主鏈構(gòu)象分析 SPI-B的消化產(chǎn)物的拉曼光譜的酰胺I帶進(jìn)行定量分析，分析采用Peakfit 4.12軟件完成，結(jié)果見表8。

由表8可知，樣品B大豆分離蛋白及消化產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊含量最高。在連續(xù)5 h的消化過程中，α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量在0～1 h時(shí)先升高而后開始降低，β-折疊結(jié)構(gòu)的含量隨著消化反應(yīng)的不斷進(jìn)行，一直呈下降的趨勢(shì)，而β-轉(zhuǎn)角含量及無規(guī)則卷曲含量變化不規(guī)律，總體而言，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的消化反應(yīng)，無規(guī)則卷曲的含量有所增加。

表8 利用酰胺I帶擬合SPI-B消化產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果Table 8 Contents of the secondary structure by Amide I bands for digestion products of SPI-B

2）側(cè)鏈構(gòu)象分析 SPI-B消化產(chǎn)物的色氨酸譜帶相對(duì)強(qiáng)度及酪氨酸費(fèi)米共振線I850/I830分析結(jié)果見表9。

由表9可知，樣品B的大豆分離蛋白及不同時(shí)間的消化產(chǎn)物的I850/I830在1.01～1.02之間，其酪氨酸殘基趨向于“暴露式”，5 h消化過程中，酪氨酸費(fèi)米共振線I850/I830比值及殘基暴露變化不明顯。而由表9可知，760 cm-1附近區(qū)域的拉曼峰色氨酸譜帶強(qiáng)度在整個(gè)消化反應(yīng)中也一直呈下降趨勢(shì)。

表9 SPI-B消化產(chǎn)物的I850/I830及酪氨酸殘基分析結(jié)果Table 9 I850/I830and tyrosine residues analysis results of digestion products of SPI-B

2.3.3 陜豆125號(hào)（C）的拉曼光譜分析 樣品C（SPI-C）大豆蛋白的拉曼光譜如圖13所示，其譜峰的歸屬見表10。

圖13 不同消化時(shí)間樣品C及消化產(chǎn)物的拉曼光譜圖Fig.13 Raman spectra of digestion products of SPI-C with different digestion time

表10 SPI-C消化產(chǎn)物的拉曼光譜及特征頻率歸屬Table 10 Raman spectrum and assignment of characteristic bands of digestion products of SPI-C

（續(xù)表10）

1）主鏈構(gòu)象分析 SPI-C的消化產(chǎn)物的酰胺I帶進(jìn)行定量分析，分析采用Peakfit 4.12軟件完成，結(jié)果見表11。

表11 利用酰胺I帶擬合SPI-C消化產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果Table 11 Contents of the secondary structure by Amide I bands for digestion products of SPI-C

由表11可知，在連續(xù)5 h的消化過程中，樣品SPI-C消化產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸升高的趨勢(shì)，β-折疊結(jié)構(gòu)的含量與β-轉(zhuǎn)角含量在消化反應(yīng)過程中不斷降低，而無規(guī)則卷曲含量變化不規(guī)律。

2）側(cè)鏈構(gòu)象分析 SPI-C消化產(chǎn)物的色氨酸譜帶相對(duì)強(qiáng)度及酪氨酸費(fèi)米共振線I850/I830分析結(jié)果見表12。

由表12可知，樣品SPI-C及不同時(shí)間的消化產(chǎn)物的I850/I830在1.01～1.02之間，其酪氨酸殘基趨向于“暴露式”，5 h消化反應(yīng)，酪氨酸費(fèi)米共振線I850/I830比值及殘基暴露變化不明顯。而由表12可知，760 cm-1附近區(qū)域的拉曼峰色氨酸譜帶強(qiáng)度在整個(gè)消化反應(yīng)中也一直呈下降趨勢(shì)。

表12 SPI-C消化產(chǎn)物的I850/I830及酪氨酸殘基分析結(jié)果Table 12 I850/I830and tyrosine residues analysis results of digestion products of SPI-C

2.3.4 滇豆4號(hào)（D）的拉曼光譜分析 樣品D（SPI-D）大豆蛋白的拉曼光譜如圖14所示，其譜峰的歸屬見表13。

圖14 不同消化時(shí)間樣品D及消化產(chǎn)物的拉曼光譜圖Fig.14 Raman spectra of digestion products of SPI-D with different digestion time

表13 SPI-D消化產(chǎn)物的拉曼光譜及特征頻率歸屬Table 13 Raman spectrum and assignment of characteristic bands of digestion products of SPI-D

1）主鏈構(gòu)象分析 SPI-D消化產(chǎn)物的酰胺I帶進(jìn)行定量分析，分析采用Peakfit 4.12軟件完成，結(jié)果見表14。

表14 利用酰胺I帶擬合SPI-D消化產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果Table 14 Contents of the secondary structure by Amide I bands for digestion products of SPI-D

由表14可知，在連續(xù)5 h的消化過程中，樣品SPI-D大豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，β-折疊結(jié)構(gòu)的含量在消化反應(yīng)過程中不斷降低，而β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量及無規(guī)則卷曲含量變化不規(guī)律，總體而言，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的消化反應(yīng)，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量有所增加。

2）側(cè)鏈構(gòu)象分析 SPI-D消化產(chǎn)物的色氨酸譜帶相對(duì)強(qiáng)度及酪氨酸費(fèi)米共振線I850/I830分析結(jié)果見表15。

表15 SPI-D消化產(chǎn)物的I850/I830及酪氨酸殘基分析結(jié)果Table 15 I850/I830and tyrosine residues analysis results of digestion products of SPI-D

由表15可知，樣品SPI-D及不同時(shí)間的消化產(chǎn)物的I850/I830在1.00～1.02之間，其酪氨酸殘基趨向于“暴露式”，酪氨酸費(fèi)米共振線I850/I830比值及殘基暴露的變化趨勢(shì)不明顯。而由表15可知，760 cm-1附近區(qū)域的拉曼峰色氨酸譜帶強(qiáng)度在整個(gè)消化反應(yīng)中也一直呈降低趨勢(shì)。

2.3.5 冀豆15號(hào)（E）的拉曼光譜分析 樣品E（SPI-E）大豆蛋白的拉曼光譜如圖15所示，其譜峰的歸屬見表16。

圖15 不同消化時(shí)間樣品E及消化產(chǎn)物的拉曼光譜圖Fig.15 Raman spectra of digestion products of SPI-E with different digestion time

表16 SPI-E消化產(chǎn)物的拉曼光譜及特征頻率歸屬Table 16 Raman spectrum and assignment of characteristic bands of digestion products of SPI-E

（續(xù)表16）

1）主鏈構(gòu)象分析 SPI-E消化產(chǎn)物的酰胺I帶進(jìn)行定量分析，分析采用Peakfit 4.12軟件完成，結(jié)果見表17。

表17 利用酰胺I帶擬合SPI-E消化產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果Table 17 Contents of the secondary structure by Amide I bands for digestion products of SPI-E

由表17可知，樣品SPI-E及消化產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)呈先下降后上升的波動(dòng)變化趨勢(shì)，β-折疊結(jié)構(gòu)的含量在消化反應(yīng)過程中的不斷降低，而β-轉(zhuǎn)角含量在整個(gè)消化過程，總體而言呈不斷上升趨勢(shì)，無規(guī)則卷曲的總含量有所降低，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的消化反應(yīng)，樣品SPI-E消化產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-轉(zhuǎn)角含量最高。

2）側(cè)鏈構(gòu)象分析 SPI-E消化產(chǎn)物的色氨酸譜帶相對(duì)強(qiáng)度及酪氨酸費(fèi)米共振線I850/I830分析結(jié)果見表18。

由表18可知，樣品SPI-E及不同時(shí)間消化產(chǎn)物的I850/I830在1.00～1.02之間，其酪氨酸殘基趨向于“暴露式”，酪氨酸費(fèi)米共振線I850/I830比值及殘基暴露的變化不明顯。而由表18可知，760 cm-1附近區(qū)域的拉曼峰色氨酸譜帶強(qiáng)度在整個(gè)消化反應(yīng)中也一直呈下降趨勢(shì)。

表18 SPI-E消化產(chǎn)物的I850/I830及酪氨酸殘基分析結(jié)果Table 18 I850/I830and tyrosine residues analysis results of digestion products of SPI-E

5種大豆分離蛋白及消化產(chǎn)物的主鏈構(gòu)象拉曼光譜的酰胺I帶進(jìn)行定量分析可知，SPI-B具有最高含量的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)而α-螺旋含量最低；SPI-C具有最高含量的β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，而在整個(gè)消化過程中，5種樣品的大豆分離蛋白及消化產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊結(jié)構(gòu)含量變化均呈下降趨勢(shì)，其它二級(jí)結(jié)構(gòu)元素含量變化不規(guī)律[18]。這與紅外光譜分析結(jié)果基本一致。在對(duì)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)影響的研究中發(fā)現(xiàn)，5個(gè)SPI樣品及其消化產(chǎn)物的酪氨酸殘基趨向于“暴露式”，隨著消化反應(yīng)的不斷進(jìn)行，不同樣品的酪氨酸峰在850 cm-1和830 cm-1處的強(qiáng)度比值（I850/I830）變化存在略微差異，而隨著消化反應(yīng)的不斷進(jìn)行，酪氨酸雙峰比值及殘基暴露的變化不明顯，在本研究經(jīng)過消化酶解后大豆蛋白的拉曼圖譜，5種樣品在760cm-1附近區(qū)域的拉曼峰強(qiáng)度均有所降低，該區(qū)域歸屬于色氨酸殘基的伸縮振動(dòng)。

3 結(jié)論

本文通過對(duì)我國(guó)5種大豆分離蛋白體外模擬消化模式研究，運(yùn)用多種蛋白質(zhì)分析檢測(cè)手段，主要研究結(jié)果如下：大豆分離蛋白及消化產(chǎn)物的紅外光譜及拉曼光譜分析二級(jí)結(jié)構(gòu)元素含量變化規(guī)律基本一致，α-螺旋結(jié)構(gòu)、β-折疊結(jié)構(gòu)與DH呈現(xiàn)出一定相關(guān)性。在反應(yīng)進(jìn)行0.5 h的短時(shí)消化酶解，樣品的蛋白質(zhì)中α-螺旋結(jié)構(gòu)與DH具有極顯著的正相關(guān)；而樣品中β-折疊結(jié)構(gòu)在長(zhǎng)時(shí)間消化反應(yīng)過程中與DH的相關(guān)性逐漸明顯，在反應(yīng)進(jìn)行5 h后，β-折疊結(jié)構(gòu)與DH呈現(xiàn)出顯著負(fù)相關(guān)。拉曼光譜結(jié)果顯示，經(jīng)過消化酶解后色氨酸殘基由包埋的疏水的微環(huán)境轉(zhuǎn)為暴露的展開形式，表明色氨酸殘基趨近于“暴露”態(tài)，這可能是由于消化過程中蛋白質(zhì)發(fā)生變性、分子結(jié)構(gòu)展開導(dǎo)致的。