食源性柚皮苷抗氧化性及其對呋喃所致小鼠肝腎損傷的保護作用

袁 媛 劉黃友 閆海洋* 孫 冶

（1吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 長春 130062

2長春市九臺區(qū)雞鳴山中心學(xué)校 長春 130500）

柚皮苷（Naringin），雙氫黃酮類物質(zhì)，主要存在于蕓香科柑橘屬植物柚、酸橘、葡萄及其變異的果實和變異的果皮中[6]，在食品工業(yè)領(lǐng)域用于風(fēng)味改良劑和天然著色劑[7]。國內(nèi)科研機構(gòu)主要致力于柚皮苷對抑制癌細胞和保護正常細胞的活性作用，研究表明柚皮苷對于輻射所引起的細胞變化起到抑制作用[8]。柚皮苷作為常見的生物抗氧化劑，具有抑酶、降血壓、降血糖、抗氧化、抗癌、抗衰老等藥理作用；抑制癌基因表達，誘導(dǎo)癌細胞凋亡，抗癌細胞增殖，抗自由基等生物活性作用[9]。目前還沒發(fā)現(xiàn)利用小鼠肝、腎損傷模型來研究和評價柚皮苷對呋喃所致?lián)p傷的保護作用。本文首先利用DPPH·法、ABTS+法、鄰二氮菲-Fe2+還原法、硝基四氮唑藍法及亞油酸過氧化法評價柚皮苷清除自由基的能力和抗氧化活性；再以小鼠為實驗動物，從ROS含量變化、氧化損傷、細胞因子水平、DNA損傷和肝腎損傷相關(guān)指標(biāo)揭示柚皮苷對呋喃所致小鼠肝、腎毒性的保護作用，以期為呋喃體內(nèi)毒性防護提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康雄性BALB/C小鼠6～7周齡，體重20 g，吉林大學(xué)動物中心提供；呋喃（CAS：110-00-9，純度≥98%）、 柚皮苷（CAS：10236-47-2，純度≥95%）和二甲基亞砜（CAS：67-68-5，純度≥99%）均購于 Sigma公司（美國）；細胞活性氧（ROS）、8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），美國 R&D 公司提供；血清尿素氮（BUN）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、血清肌酐（creatinine）、乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原性谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、髓過氧化物酶（MPO）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）等試劑盒，購于中國南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 柚皮苷抗氧化活性分析 分別用DPPH·法[10]，ABTS+法[10]，鄰二氮菲-Fe2+還原法[11]，硝基四氮唑藍法[12]考察柚皮苷清除自由基能力；通過亞油酸過氧化法[13]考察柚皮苷的脂過氧化抑制能力。

1.2.2 實驗動物設(shè)計 50只健康雄性BALB/C小鼠，隨機分成5組（每組10只），分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22℃±2℃、相對濕度30%±10%，自由采食、飲水適應(yīng)性喂養(yǎng)一周[14]。動物分組情況如下：

對照組：用75%的生理鹽水連續(xù)灌胃14 d；

呋喃染毒組（16 mg/kg/d）：用75%的生理鹽水連續(xù)灌胃14 d，第8天開始以16 mg/kg/d劑量腹腔注射呋喃，連續(xù)7 d；

5 mg/kg/d柚皮苷保護組：柚皮苷以5 mg/kg/d劑量連續(xù)灌胃14 d，第8天開始以16 mg/kg/d劑量腹腔注射呋喃，連續(xù)7 d；

10 mg/kg/d柚皮苷保護組：柚皮苷以10 mg/kg/d劑量連續(xù)灌胃14 d，第8天開始以16 mg/kg/d劑量腹腔注射呋喃，連續(xù)7 d；

1.面向基層設(shè)立統(tǒng)戰(zhàn)工作實踐創(chuàng)新成果獎。中央和各省（自治區(qū)、直轄市）黨委統(tǒng)戰(zhàn)部門，要按照不同資源條件、不同方向原則，配備必要的專項工作經(jīng)費，指導(dǎo)各地區(qū)縣、鄉(xiāng)（鎮(zhèn)、街道）持續(xù)開展項目化、特色化基層統(tǒng)戰(zhàn)工作品牌建設(shè)，促進基層統(tǒng)戰(zhàn)工作抓手的多樣化、個性化；幫助基層總結(jié)經(jīng)驗，提煉推廣成果，促進工作創(chuàng)新，增強工作實效。

20 mg/kg/d柚皮苷保護組：柚皮苷以20 mg/kg/d劑量連續(xù)灌胃14 d，第8天開始以16 mg/kg/d劑量腹腔注射呋喃，連續(xù)7 d。

1.2.3 動物處理 給藥14 d后，小鼠禁食24 h，眼球采血，4℃靜置1～2 h，待血清析出后，2 500 r/min離心15 min，分離取血清，待測。將采血后的小鼠處死解剖，取出肝腎組織，生理鹽水清洗，濾紙拭干后稱重。并用組織質(zhì)量9倍的生理鹽水在冰水浴中研磨成漿，10%的組織勻漿3 000 r/min離心15min，取上清液待測[15]。

1.2.4 指標(biāo)測定 參照試劑盒說明書，分別檢測ROS、氧化損傷指標(biāo)（GST、GSH 活性，SOD、MPO、MDA 含量）、細胞因子水平（TNF-α、（IL）-1β、（IL）-6、（IL）-10 含量）、DNA 損傷（8-OHdG 含量）、肝腎損傷（AST、ALT活性，BUN、LDH 及 Creatinine含量）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS.19軟件分析差異顯著性，P<0.05為差異顯著，各項指標(biāo)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 柚皮苷的抗氧化活性分析

亞油酸過氧化法測定柚皮苷抑制脂質(zhì)氧化試驗時，當(dāng)柚皮苷添加質(zhì)量濃度為0.005 mg/mL時，其脂質(zhì)氧化抑制率達到14.89%，結(jié)果表明柚皮苷能夠抑制脂質(zhì)氧化。DPPH自由基清除能力，ABTS自由基清除能力，·OH清除能力和·O2-清除能力隨著柚皮苷濃度的增加，其自由基清除能力在一定范圍內(nèi)呈線性增加（表1）。柚皮苷對DPPH自由基，ABTS自由基，·OH和·O2-的 IC50值分別為0.853，0.809，0.037 及 0.045 mg/mL，說明柚皮苷對·OH自由基具有很強的清除能力。

2.2 柚皮苷對ROS 含量的影響

細胞活性氧（ROS）具有很強的生物活性，可通過細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細胞凋亡甚至導(dǎo)致其壞死[16]。圖1顯示了小鼠血清中ROS的變化，呋喃染毒組與對照組相比，ROS含量顯著升高（P<0.05），對照組與呋喃染毒組相比ROS含量從（135.32±6.21）U/mL 上升到（268.16±8.20）U/mL，而食源性柚皮苷的保護組ROS含量均下降，其中10 mg/kg/d柚皮苷保護組與呋喃染毒組相比，ROS含量顯著下降（P<0.05），接近于對照組水平。在體外抗氧化試驗中，柚皮苷對·OH（0.037 mg/mL）、·O2-（0.045 mg/mL）等 ROS 自由基具有很好的清除能力，由此看出柚皮苷可以通過降低ROS含量，緩解細胞氧化。

表1 柚皮苷清除自由基能力Table 1 Antioxidant activity of naringin against scavenging free radicals

圖1 食源性柚皮苷對呋喃所致小鼠ROS含量的影響Fig.1 Effects of foodborne naringin on ROS content in the serum of furan treated mice

2.3 柚皮苷對小鼠肝腎氧化損傷的影響

表2顯示了小鼠肝腎組織中MPO的變化，呋喃染毒組較對照組MPO含量顯著升高（P<0.05），而添加柚皮苷的保護組中MPO含量均下降，其中10 mg/kg/d柚皮苷保護組接近對照組水平。GST和GSH是肝腎組織的抗氧化指標(biāo)，能夠反應(yīng)肝腎器官的氧化損傷情況。呋喃染毒組較對照組GST和GSH含量顯著降低（P<0.05），其中肝對照組與肝染毒組相比GSH含量從（7.14±0.72）μmol/g降低到（3.26±0.88）μmol/g，GST 含量從（103.463±6.44）U/mg下降到（69.322±3.35）U/mg。而食源性柚皮苷的保護組GST和GSH含量均升高，其中10 mg/kg/d柚皮苷保護組的GST和GSH含量已經(jīng)接近對照組水平，同時5 mg/kg/d和20 mg/kg/d柚皮苷保護組與呋喃染毒組相比較，GST和GSH含量顯著升高（P<0.05）。

通過檢測MDA含量可以反映機體脂質(zhì)過氧化的程度[16]。呋喃染毒組與對照組相比，MDA含量明顯升高（P<0.05），小鼠腎臟組織中的對照組與保護組相比較，5 mg/kg/d柚皮苷保護組（5.123 nmol/mg±0.38 nmol/mg）與 20 mg/kg/d柚皮苷保護組（4.039 nmol/mg±0.18 nmol/mg）較對照組均偏高，而10 mg/kg/d柚皮苷保護組MDA含量為3.924 nmol/mg±0.54 nmol/mg接近于對照組水平（表2）。SOD的測定常與MDA相互配合，MDA水平升高，SOD活性降低，即可引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細胞損傷甚至死亡。通過試驗發(fā)現(xiàn)腎呋喃染毒組（29.925 U/mg±1.72 U/mg）較腎對照組（84.091 U/mg± 4.11 U/mg），SOD 含量明顯降低（P<0.05）而柚皮苷保護組中SOD含量明顯升高（P<0.05），其中10 mg/kg/d柚皮苷保護組與呋喃染毒組相比較，肝臟中由91.251 U/mg±2.1 U/mg升高到196.025 U/mg±5.6 U/mg；腎臟中由 29.925 U/mg±1.72 U/mg升高到 79.891 U/mg±3.93 U/mg，均接近于對照組水平。以上結(jié)果表明食源性柚皮苷可以通過升高SOD的含量，降低MDA含量從而對小鼠起到保護作用。

綜上所述，食源性柚皮苷可以通過降低小鼠肝腎組織中MPO和MDA的含量，增加肝腎組織中GST、GSH和SOD的含量，從而降低由呋喃氧化所造成肝腎的氧化損傷。

2.4 柚皮苷對小鼠細胞因子水平的影響

從表3可以看出呋喃染毒組和對照組比較細胞因子 IL-6，IL-1β，IL-10和TNF-α 明顯增加（P<0.05）。隨著柚皮苷濃度的增加，IL-6水平降低，當(dāng)柚皮苷質(zhì)量濃度為10 mg/kg/d時，IL-6的水平從2.418 pg/m±0.096 pg/mL降低到1.183 pg/mL±0.459 pg/mL，與對照組無顯著差異（P＞0.05）；10 mg/kg/d柚皮苷保護組中IL-1β和TNF-α明顯降低（P＜0.05）。

表2 食源性柚皮苷對呋喃所致小鼠肝臟和腎臟組織中MPO、GST、GSH和SOD含量影響Table 2 Effects of foodborne naringin on MPO，GST，GSH and SOD content of liver and kidney tissue in mice induced by furan

表3 食源性柚皮苷對呋喃所致小鼠血清中IL-10、IL-1β、IL-6及TNF-α含量影響Table 3 Effects of foodborne naringin on IL-10，IL-1β，IL-6 and TNF-α content of serum in mice induced by furan

2.5 柚皮苷對DNA損傷的影響

8-OHdG是DNA氧化損傷的特異產(chǎn)物，我們通過檢測小鼠血清中8-OHdG的含量變化來研究食源性柚皮苷對呋喃染毒小鼠血清中DNA損傷的影響。如圖2所示，經(jīng)呋喃染毒（16 mg/kg/d）7d后，呋喃染毒組較對照組，8-OHdG的含量明顯增加（P＜0.05），達到 1.427 ng/mL±0.055 ng/mL，高出近3倍。灌胃不同濃度的柚皮苷后，小鼠血清中8-OHdG的含量變化顯著說明食源性柚皮苷對呋喃染毒小鼠血清中DNA損傷具有一定的保護作用。

圖2 食源性柚皮苷對呋喃所致小鼠8-OHdG含量的影響Fig.2 Effects of foodborne naringin on 8-OHdG content in the serum of furan treated mice

2.6 柚皮苷對小鼠肝腎損傷的作用

如表4所示，16 mg/kg/d呋喃染毒組較對照組，ALT、AST、LDH 活性和BUN、肌酐水平明顯提高（P<0.05）。研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷保護組較呋喃染毒組血清中的AST和ALT活性明顯降低（P<0.05）。當(dāng)用10 mg/kg/d柚皮苷灌胃小鼠后，AST活性（14.21 U/L±1.56 U/L）仍高于對照組（13.21 U/L±1.33 U/L），但10 mg/kg/d的柚皮苷保護組有效保護了呋喃所致小鼠的肝損傷。BUN是腎功能變化的一項重要指標(biāo)，當(dāng)機體腎臟產(chǎn)生病變時會導(dǎo)致BUN濃度升高，排泄功能發(fā)生障礙，新生代謝失調(diào)[17]。染毒組與對照組相比BUN含量顯著升高（P<0.05），對照組與染毒組相比BUN含量從22.27 mmol/L±4.23 mmol/L上升到26.07 mmol/L±3.38 mmol/L，而添加食源性柚皮苷的保護組BUN含量均有所下降，10 mg/kg/d柚皮苷保護組已經(jīng)接近對照組水平（表4）。LDH是一種在腎臟中含量較高的糖酵解酶，對照組與染毒組相比LDH含量從1 860.22 U/L±109.2 U/L上升到3 462.37 U/L±221.5 U/L，呋喃染毒造成了小鼠腎臟的損傷，而添加食源性柚皮苷的保護組LDH含量均有所下降，其中10 mg/kg/d柚皮苷保護組LDH含量顯著下降（P<0.05）。表4中呋喃染毒組 LDH活性、BUN和肌酐水平較對照組明顯增加（P<0.05）。10 mg/kg/d的柚皮苷治療組用藥14 d后，LDH活性，BUN和肌酐水平均接近于對照組水平，由此可知食源性柚皮苷對呋喃所致小鼠肝腎損傷具有保護作用。

表4 食源性柚皮苷對呋喃所致小鼠血清中AST、ALT、BUN、LDH及Cr含量影響Table 4 Effects of foodborne naringin on AST，ALT，BUN，LDH and creatinine content of serum in mice induced by furan

3 討論

細胞活性氧（ROS），如超氧陰離子（O2-），過氧化氫（H2O2），和羥基自由基（·OH）與人類很多疾病息息相關(guān)。我們利用小鼠模型研究了呋喃和柚皮苷對ROS的相互影響，并結(jié)合柚皮苷體外抗氧化試驗（表1）結(jié)果，可以看出柚皮苷具有一定的清除自由基如·OH和·O2-的能力，并可能對呋喃所致ROS含量降低起重要的作用。GSH作為一種重要的細胞內(nèi)抗氧化劑，有助于保持細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的硫醇基和生物體的抗氧化[18]。呋喃染毒組中GSH的活性在肝臟和腎臟明顯下降（P<0.05），這表明GSH可能作用于呋喃誘導(dǎo)的氧化損傷。GST能夠靈敏地反映機體損傷情況，在儲存和排泄外源性化學(xué)物質(zhì)的方面也起著重要的作用。呋喃染毒組較對照組，小鼠肝腎中的GST活性明顯降低（P<0.05），呋喃誘導(dǎo)肝腎產(chǎn)生了一定程度的損傷。GST通過將有毒化合物代謝成無毒化合物已達到保護肝臟的目的[19]。小鼠GST活性被呋喃染毒所抑制并造成進一步傷害，然而柚皮苷的添加抑制了呋喃導(dǎo)致的GSH含量的降低和GST活性損傷，可以看出柚皮苷在減少呋喃誘導(dǎo)損傷中起重要作用。SOD，作為機體清除自由基的主要酶類[20]，能夠?qū)⒊趸镫x子（O2-）催化成氧氣和過氧化物，在細胞抗氧化方面起著重要的作用，常被用來評價機體的抗氧化能力[21]。小鼠經(jīng)16 mg/kg/d質(zhì)量濃度的呋喃染毒7d后，呋喃染毒組較對照組，小鼠肝腎中SOD的活性明顯降低（P<0.05），說明呋喃引起了氧化應(yīng)激反應(yīng)。MPO能利用過氧化氫和氯離子產(chǎn)生次氯酸鹽，并形成具有氧化能力的自由基。研究表明，16 mg/kg/d呋喃染毒組小鼠，MPO活性明顯增加，具有脂質(zhì)過氧化作用的氧化產(chǎn)物出現(xiàn)，與蛋白質(zhì)和DNA作用產(chǎn)生毒性和誘變[22]，造成肝腎損傷。MDA是一種可通過脂質(zhì)過氧化物分解產(chǎn)生的有害物質(zhì)，能引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，具有細胞毒性[16]，因此MDA可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細胞損傷的程度[23]。數(shù)據(jù)顯示，肝腎中MDA水平升高，意味著過氧化造成組織損傷及抗氧化劑的防御機制破壞[24]。呋喃染毒組較對照組，MDA水平明顯增高（表2），柚皮苷的添加對肝腎的氧化損傷起到了保護作用。呋喃染毒造成了小鼠體內(nèi) GST、SOD和GSH活性，以及MPO、MDA和ROS含量明顯變化，這與Cordelli等[23]研究一致。

細胞因子與細胞免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、組織損傷或細胞修復(fù)有關(guān)，在細胞正常生理中起著重要的作用[25]。如表3所示，呋喃染毒激活免疫細胞，通過釋放各種細胞因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10產(chǎn)生免疫應(yīng)答。當(dāng)小鼠灌胃柚皮苷后，血清中 TNF-α、IL-10、IL-1β、IL-6 水平顯著下降，柚皮苷能通過抑制炎癥反應(yīng)從而減輕呋喃引起的組織損傷，其較強的抗氧化能力（表1）有助于抵抗呋喃所致小鼠的炎癥反應(yīng)。8-OHdG是氧化損傷的標(biāo)志物[26]。呋喃染毒組與對照組相比較，16 mg/kg/d呋喃染毒7d后，8-OHdG的水平顯著提高（P<0.05，圖2），與Hickling等[27]研究一致。研究表明，柚皮苷可以明顯減輕呋喃所致小鼠的DNA損傷，其中10 mg/kg/d柚皮苷有最好的保護作用。

肝臟是呋喃誘導(dǎo)大鼠和小鼠毒性作用的主要靶器官，具有明顯的劑量依賴性[5]。ALT和AST是存在于肝細胞漿內(nèi)的可溶性酶，肝細胞損傷后，細胞膜的通透性增加，ALT、AST大量釋放導(dǎo)致血清中ALT、AST指標(biāo)升高[28-29]。ALT和AST的活性在一定程度上反映肝細胞壞死和損傷程度。目前將ALT、AST活性變化作為判定肝損傷程度的重要指標(biāo)[30]。研究發(fā)現(xiàn)，呋喃引起了AST的活性和ALT的活性明顯增加（表5），肝細胞嚴重損傷或者壞死，這與Moser等及Hamadeh等研究一致[31-32]。灌胃柚皮苷之后，小鼠血清中AST和ALT活性下降。同樣，LDH也是細胞損傷的一個指標(biāo)[33]，AST、ALT和LDH含量變化表明柚皮苷有效保護呋喃所致的肝損傷。BUN和Creatinine是佐證腎臟損傷最有效的方法之一[34]，因此可通過評價血清尿素氮和肌酐水平變化來研究呋喃所誘導(dǎo)小鼠的腎損傷，Gill等[35]發(fā)現(xiàn)呋喃可以顯著提高血清中BUN和肌酐含量。柚皮苷治療組（5，10，20 mg/kg/d）與呋喃染毒組相比較，柚皮苷能抑制BUN和肌酐水平的提高，有效阻止呋喃所致小鼠血清中BUN和肌酐含量增加，對肝腎損傷起到很好的保護作用。

4 結(jié)論

本研究首先提出了利用小鼠模型來研究食源性柚皮苷對呋喃所致小鼠肝腎損傷的保護作用。通過評估小鼠ROS含量，氧化損傷，細胞因子水平，DNA損傷，肝、腎損害，證實了食源性柚皮苷對呋喃毒性所致?lián)p傷具有保護作用。研究結(jié)果表明食源性柚皮苷對外源性有毒化合物（如呋喃）具有保護作用，但確切的保護機制有待進一步研究。通過研究食源性柚皮苷的抗氧化性和呋喃的毒性，為呋喃體內(nèi)毒性防護提供可靠的理論依據(jù)，也為食源性柚皮苷在食品加工領(lǐng)域中的進一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

更正說明

茲有發(fā)表在我刊2019年第19卷第8期第22-30頁上的論文：《綠豆肽對RAW264.7巨噬細胞增殖及免疫活性物質(zhì)的影響》，因作者疏忽，第一作者的出生年份有誤，現(xiàn)更正為“1981年”。

特此說明。

《中國食品學(xué)報》編輯部

2019年9月18日