低溫?cái)D出-多酶協(xié)同降解脫胚玉米中淀粉的機(jī)理

葉向庫，申德超

低溫?cái)D出-多酶協(xié)同降解脫胚玉米中淀粉的機(jī)理

葉向庫1,2，申德超3

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，保定 071001； 2. 煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺 264005；3. 山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，淄博 255091）

為了改變目前擠出酶解谷物淀粉僅添加一種酶制劑(淀粉酶)，只能降解淀粉的1,4糖苷鍵，不能降解支鏈淀粉的-1,6糖苷鍵，限制淀粉轉(zhuǎn)化成葡萄糖的收率進(jìn)一步提高的現(xiàn)狀，該文應(yīng)用低溫（≤80 ℃）擠出-多酶（-淀粉酶、糖化酶、普魯蘭酶）協(xié)同降解技術(shù)，制備擠出過程中物料的石蠟顯微制片，觀察脫胚玉米經(jīng)低溫?cái)D出-多酶協(xié)同降解處理后，細(xì)胞壁、細(xì)胞中的淀粉顆粒和蛋白質(zhì)顆粒的分布狀況以及淀粉含量、糊化度、可溶性糖含量的變化。結(jié)果表明：在擠出過程中，淀粉發(fā)生糊化和降解，表觀淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少，從81.50%減少到74.40%，可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，從1.07%增加到2.26%，擠出過程中加入酶制劑后這種變化更加明顯。添加單一淀粉酶表觀淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)從79.72%減少到69.16%，可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)從6.54%增加到7.90%。添加淀粉酶和糖化酶表觀淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)從81.42%減少到72.45%，可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)從11.65%增加到14.71%。添加-淀粉酶和普魯蘭酶表觀淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)從81.31%減少到70.31%，可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)從6.74%增加到8.29%。添加-淀粉酶、糖化酶、普魯蘭酶3種酶時淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)從81.06%減少到69.05%，可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)從11.25%增加到16.35%。因此，3種酶（-淀粉酶、糖化酶、普魯蘭酶）協(xié)同作用對淀粉降解以及可溶性糖含量的增加作用效果最好。顯微切片的分析結(jié)果表明：添加3種酶制劑（-淀粉酶+糖化酶+普魯蘭酶）的切片，細(xì)胞結(jié)構(gòu)中淀粉顆粒被降解破壞的程度大于添加1種（耐高溫-淀粉酶）、2種（-淀粉酶+糖化酶，或者-淀粉酶+普魯蘭酶）酶制劑的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中淀粉顆粒被降解破壞的程度。低溫?cái)D出-多酶協(xié)同降解后，脫胚玉米擠出物的總淀粉含量降低、可溶性糖含量增加，糊化度增加。試驗(yàn)表明：添加3種酶制劑協(xié)同降解脫胚玉米中淀粉的作用效果優(yōu)于添加1種酶制劑或2種酶制劑的淀粉降解效果，為進(jìn)一步提高淀粉轉(zhuǎn)化成葡萄糖的收率提供科學(xué)依據(jù)。

擠壓；酶；淀粉；脫胚玉米；細(xì)胞結(jié)構(gòu)；蛋白質(zhì)；理化指標(biāo)

0 引 言

脫胚玉米中淀粉的利用，首先要經(jīng)過淀粉糊化、液化、糖化等處理，使淀粉大分子變成小分子，然后用于生產(chǎn)淀粉糖[1]以及作為發(fā)酵用原料[2]。低溫?cái)D出酶解技術(shù)改變傳統(tǒng)加水加熱進(jìn)行淀粉糊化處理的方式，采用擠壓機(jī)進(jìn)行擠出處理，完成糊化[3-7]，同時加入淀粉酶加速淀粉的降解[8]。Mercier等[9]應(yīng)用擠出酶解（添加耐溫-淀粉酶）技術(shù)，研究谷物淀粉的擠出液化、糖化過程。Vasanthanl等[10]研究添加耐溫-淀粉酶的大麥粉，經(jīng)100 ℃擠壓處理后淀粉的水解度和DE值（dextrose equivalent）增加。冉旭[11]、孫于慶[12]等人用雙螺桿擠壓機(jī)處理添加耐高溫-淀粉酶的玉米淀粉，在95 ℃時淀粉DE值達(dá)到最大。奚可畏[13]采用脫胚玉米添加-淀粉酶經(jīng)擠出處理后生產(chǎn)淀粉糖漿，DE值達(dá)到89.35%。李宏軍[14]采用外加酶法對大米擠出物進(jìn)行處理，陳善峰[15]采用低溫加酶擠壓技術(shù)對大米擠出物進(jìn)行糖化處理，麥汁浸出物收得率提高1.20%～3.04%。潘小衛(wèi)[16]在高粱中添加-淀粉酶經(jīng)擠出處理用于生產(chǎn)小曲白酒，擠出后35.71%的淀粉發(fā)生了降解。玉米淀粉中含有27%的直鏈淀粉，其余均為支鏈淀粉。支鏈淀粉中含有-1,6糖苷鍵。-淀粉酶能隨機(jī)水解淀粉中的-1,4糖苷鍵[17]，但不能水解淀粉中的-1,6糖苷鍵。擠出時只添加-淀粉酶將影響擠出物中可溶性糖和最終淀粉的利用程度。這是目前國內(nèi)外學(xué)者研究僅添加1種酶制劑（耐溫-淀粉酶）的淀粉擠出酶解技術(shù)的不足之處。

為提高玉米中淀粉支鏈淀粉的水解利用程度，本文應(yīng)用低溫?cái)D出-多酶協(xié)同降解技術(shù)[18]，研究了添加1種、2種和3種酶制劑的干法脫胚玉米中淀粉的擠出過程。試驗(yàn)應(yīng)用石蠟顯微制片技術(shù)，研究擠出前分別添加只能降解直鏈淀粉的-1,4糖苷鍵的一種酶制劑（耐高溫-淀粉酶），以及既能降解-1,4糖苷鍵又能降解支鏈淀粉的-1,6糖苷鍵的2種酶制劑（耐高溫-淀粉酶和糖化酶或者耐高溫-淀粉酶和普魯蘭酶）和3種酶制劑（耐高溫-淀粉酶、糖化酶、普魯蘭酶）的干法脫胚玉米，在擠出過程中，螺桿外表面和套筒內(nèi)表面的擠出腔體中的不同取樣點(diǎn)物料的脫胚玉米細(xì)胞壁及細(xì)胞中的淀粉顆粒和蛋白質(zhì)顆粒等物質(zhì)的變化情況。揭示物料在擠出過程受到的機(jī)械剪切力、熱和添加的酶制劑對細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及細(xì)胞中的淀粉顆粒和蛋白質(zhì)顆粒分布的影響規(guī)律，為擠出酶解技術(shù)在制糖及其衍生物生產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

脫胚玉米，購于淄博潘莊糧油市場（含水率13.5%（濕基））；耐高溫-淀粉酶（活力4×104U/mL，煙臺麥特爾生物科技有限公司）；糖化酶（4×104U /mL，諾維信生物技術(shù)有限公司）；普魯蘭酶（1×103U/mL，煙臺麥特爾生物科技有限公司）；中性蛋白酶（1×105U/mL，諾維信生物技術(shù)有限公司）；固綠（南京奧多福尼生物科技有限公司）；番紅（天津市登科化學(xué)試劑有限公司）；其他化學(xué)試劑沒有特殊說明均為分析純試劑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 脫胚玉米低溫?cái)D出-多酶協(xié)同降解的樣品處理

取脫胚玉米（含水率13.5%）2 kg，在前人研究的基礎(chǔ)上[18-19]，加水調(diào)至含水率30%，加酶制劑拌勻，放置30 min，使水分分布均勻，經(jīng)單螺桿擠出機(jī)（SSE-95套筒整體剖分式單螺桿擠出機(jī)，山東理工大學(xué)、淄博匯創(chuàng)生物科技有限公司研制）擠出加工，其中，螺桿轉(zhuǎn)速（≤130 r/min），機(jī)筒溫度（≤80 ℃），?？字睆剑ā?4 mm）均可調(diào)整，在正常出料的情況下突然停機(jī)，迅速打開套筒，沿螺桿順序1、2、3、4、5、6取樣，如圖1所示。

圖1 擠出機(jī)內(nèi)取樣點(diǎn)示意圖

1.2.2 制備石蠟顯微切片

石蠟顯微切片采用常規(guī)制備技術(shù)[20]，不同之處在于：1）脫胚玉米由于是成熟的細(xì)胞組織，新陳代謝較慢，不需固定，直接進(jìn)行脫水操作。并且水分含量較低，初始脫水可以選取酒精濃度稍高一些，從70%酒精開始進(jìn)行脫水操作；2）脫胚玉米中細(xì)胞壁染色，用1%番紅和1%固綠對切片中細(xì)胞壁進(jìn)行染色；3）蛋白質(zhì)和淀粉染色，取切好的石蠟切片放置于載玻片上，滴一滴碘-碘化鉀（I-KI）[21]溶液，蓋上蓋玻片，蛋白質(zhì)和淀粉同時染色，顯微鏡下觀察，蛋白質(zhì)呈黃色，淀粉呈藍(lán)色。

1.2.3 低溫?cái)D出-酶解過程中干法脫胚玉米取樣點(diǎn)的確定

低溫?cái)D出分別添加1種酶制劑（耐高溫-淀粉酶）、2種酶制劑（耐高溫-淀粉酶+糖化酶）和3種酶制劑（耐高溫-淀粉酶+糖化酶+普魯蘭酶）的干法脫胚玉米在擠出過程[18]中，如圖1所示，分別選取在擠出機(jī)內(nèi)的1至6取樣點(diǎn)物料，制作石蠟顯微切片，以未添加酶制劑樣品為對照樣，觀察在擠出過程中添加不同酶制劑組合，對擠出過程中脫胚玉米細(xì)胞中細(xì)胞壁、淀粉顆粒、蛋白質(zhì)顆粒變化的影響規(guī)律。

以下圖例標(biāo)示的說明：A—脫胚玉米原料（對照樣），A后的1、2、3、4、5、6為擠出機(jī)中如圖1所示的6個取樣點(diǎn)，下同；B—脫胚玉米中添加-淀粉酶的脫胚玉米，添加量為0.5L/t；C—脫胚玉米中添加-淀粉酶+糖化酶的脫胚玉米，-淀粉酶的添加量為0.5 L/t，糖化酶添加量1.46 L/t；D—脫胚玉米中添加-淀粉酶+普魯蘭酶的脫胚玉米，-淀粉酶的添加量為0.5 L/t，普魯蘭酶添加量0.7 L/t；E—脫胚玉米中添加-淀粉酶+糖化酶+普魯蘭酶的脫胚玉米，-淀粉酶的添加量為0.5 L/t，糖化酶添加量1.46 L/t，普魯蘭酶添加量0.7 L/t；F—脫胚玉米中添加中性蛋白酶的脫胚玉米，中性蛋白酶的添加量為0.4 L/t。

1.2.4 測試指標(biāo)及測定方法

可溶性糖的測定采用《食品分析（第二版）》（王永華，2017）中規(guī)定的方法[22]?？扇苄蕴峭ǔＪ侵甘称分杏坞x態(tài)的單糖、雙糖、低聚糖等可溶于水的碳水化合物。測定時常以水作為提取劑，溫度控制在40～50 ℃，溫度過高，提取可溶性糖的同時還會溶出較多的糊精和可溶性淀粉等成分。提取液中除可溶性糖外，還可能含有蛋白質(zhì)、淀粉、果膠、色素、有機(jī)酸等干擾物質(zhì)，因此后期要通過添加澄清劑將干擾物質(zhì)除去。通過試驗(yàn)，選用中性醋酸鉛作為澄清劑效果較好，可有效除去蛋白質(zhì)、果膠、單寧、有機(jī)酸等雜質(zhì)，不會沉淀樣液中的還原糖，對試驗(yàn)結(jié)果影響較小。

糊化度測定參考《糧油食品品質(zhì)分析》（王肇慈，2000）中第四章第四節(jié)“淀粉度的測定（酶水解法）”[23]。

淀粉含量的測定采用GB5009.9-2016中的酶水解法。

水分測定采用GB5009.3-2016中的直接干燥法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

收集試驗(yàn)數(shù)據(jù)，取2次獨(dú)立測定的算術(shù)平均值為測定結(jié)果，對于淀粉，按GB5009.9-2016中規(guī)定，兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。糊化度和可溶性糖，參照GB/T6379.1《測量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精確度）》的要求執(zhí)行。所有試驗(yàn)結(jié)果均以MEAN±SD表示，采用IBM SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫?cái)D出-多酶協(xié)同降解干法脫胚玉米中淀粉的理化指標(biāo)的變化規(guī)律

脫胚玉米作為發(fā)酵原料，人們主要利用其中的淀粉。脫胚玉米中的淀粉在擠出機(jī)內(nèi)發(fā)生的一系列變化，是擠出技術(shù)能否用于發(fā)酵原料預(yù)處理工序的關(guān)鍵所在。本文從脫胚玉米在擠出機(jī)中淀粉含量、糊化度、可溶性糖的變化情況來探討理化指標(biāo)的變化規(guī)律。

2.1.1 低溫?cái)D出過程中添加不同酶制劑對脫胚玉米淀粉含量的影響規(guī)律

脫胚玉米經(jīng)低溫?cái)D出處理，從喂料口到擠出?？滋?，淀粉含量逐漸降低，添加酶的種類和數(shù)量的不同降低程度也有差別。如表1所示，考慮玉米籽粒中淀粉顆粒包埋在蛋白質(zhì)基質(zhì)中，添加蛋白酶有利于淀粉的釋放和水解，但實(shí)際效果并不理想。添加中性蛋白酶對淀粉的作用最弱，從喂料口到擠出端，淀粉總量降低只有2.31個百分點(diǎn)，而以添加-淀粉酶、糖化酶、普魯蘭酶3種酶混合的降解程度最大，達(dá)到12.01個百分點(diǎn)。在擠出機(jī)中添加的酶中以-淀粉酶在擠出機(jī)中對玉米淀粉的作用最明顯，對淀粉降解效果最好。而添加糖化酶的效果不明顯，在擠出過程中僅在擠出?？椎臉O短距離內(nèi)發(fā)揮了一定的作用，可能是前期擠出機(jī)內(nèi)的條件不適宜糖化酶的作用。添加普魯蘭酶效果要稍好一些。未加酶制劑的樣品擠出物中的淀粉含量均高于添加淀粉酶的樣品。

%

表1 擠出機(jī)內(nèi)淀粉含量沿螺桿的變化

注：處理?xiàng)l件A~F含義見試驗(yàn)方法1.2.3節(jié)，取樣點(diǎn)1~6見圖1，下同

Note: See section 1.2.3 for the meaning of treatment condition A-F, see Fig.1 for the meaning of sampling section 1-6, the same below.

對表1中淀粉含量進(jìn)行方差分析，如表2所示，處理?xiàng)l件中＜0.001，表明處理?xiàng)l件的變化對淀粉含量有極顯著的影響。取樣點(diǎn)的＜0.001，表明取樣點(diǎn)的不同對淀粉含量也有極顯著的影響。從值可以看出，取樣點(diǎn)對淀粉含量的影響要大于處理?xiàng)l件對淀粉含量的影響。進(jìn)行多重比較時發(fā)現(xiàn)，A樣品與B和E的＜0.05，存在差異性；A與F的＜0.01，差異顯著。

表2 淀粉含量方差分析

2.1.2 低溫?cái)D出過程中添加不同酶制劑對淀粉糊化度的影響規(guī)律

脫胚玉米經(jīng)低溫?cái)D出處理，淀粉糊化度均有不同程度的提高[24]。加酶與不加酶以及加酶的種類均對擠出過程淀粉糊化產(chǎn)生影響。對于B、C、D、E樣品，由于加入淀粉酶，在擠壓機(jī)擠出過程中，已糊化的淀粉在淀粉酶的作用下部分發(fā)生水解，變成小分子物質(zhì)。在使用酶法測定糊化度的過程中，已變成小分子的部分作為空白被扣除，使分子和分母的總量均變小，從表1中淀粉總量的減少和可溶性糖含量的增加均能說明這一現(xiàn)象，減少的程度隨添加淀粉酶的種類不同而產(chǎn)生差異，表現(xiàn)出擠出物糊化度測定的量產(chǎn)生了不確定性，從這方面可以看出，對于添加淀粉酶的擠出物樣品，糊化度并不是對擠壓降解效果評價的較好指標(biāo)。而添加蛋白酶的F樣品由于擠出過程中對淀粉無水解作用，同時蛋白水解釋放出更多的淀粉有利于擠出過程中的糊化作用，F(xiàn)樣品糊化度最高，達(dá)到96.2%。表3為擠出機(jī)內(nèi)淀粉糊化度沿螺桿的變化

表3 擠出機(jī)內(nèi)淀粉糊化度沿螺桿的變化

對表3中淀粉糊化度進(jìn)行方差分析，如表4所示，處理?xiàng)l件中=0.007＜0.01，表明處理?xiàng)l件的變化對淀粉糊化度有顯著的影響。取樣點(diǎn)的＜0.001，表明取樣點(diǎn)的不同對淀粉糊化度有極顯著的影響。從值可以看出，取樣點(diǎn)對淀粉糊化度的影響要大于處理?xiàng)l件對淀粉糊化度的影響。進(jìn)行多重比較時發(fā)現(xiàn)，A樣品與B、C、E的值均小于0.01，有顯著性差異；A與D的=0.017＜0.05，也存在差異性。也就是表明添加1種、2種和3種淀粉酶制劑的樣品，經(jīng)擠壓后糊化度均與未加酶的樣品存在明顯的差異，而添加蛋白酶的樣品F與未加酶的樣品A對糊化度的影響無明顯差異。

表4 淀粉糊化度方差分析

2.1.3 低溫?cái)D出過程中添加不同酶及其組合對可溶性糖的影響規(guī)律

脫胚玉米在擠出機(jī)內(nèi)受到強(qiáng)的摩擦、破碎、剪切、熔融等機(jī)械作用力，淀粉鏈部分發(fā)生斷裂，還原性末端增加，同時會有部分脫落形成小分子物質(zhì)，可溶性糖類增加，添加酶制劑后這種現(xiàn)象更加明顯。

從表5可以看出，脫胚玉米經(jīng)擠出后可溶性糖均有所增加，但擠出過程中添加不同酶制劑，產(chǎn)生可溶性糖的量差異較大。不加酶的脫胚玉米可溶性糖變化最小，從喂料端的1.07%上升到出料端的2.26%，只上升了1.19個百分點(diǎn)。而加入糖化酶的脫胚玉米擠出過程中可溶性糖增加較多，從11.65%上升到14.71%，上升了3.06個百分點(diǎn)。尤以3種酶協(xié)同作用使淀粉降解最明顯，產(chǎn)生的可溶性糖最多，從11.25%上升到16.35%，上升了5.1個百分點(diǎn)。另外，添加酶制劑的樣品在喂料端未經(jīng)擠出處理就具有了較高的可溶性糖，究其原因，可能是擠出前調(diào)整水分含量時補(bǔ)加一定量的水，同時加入酶制劑，為使原料水分分布均勻，需在室溫條件下放置一定時間，在此期間以及取樣測定之前，酶制劑緩慢作用于脫胚玉米中的淀粉，尤以糖化酶最為明顯，使初始的可溶性糖含量增加。

表5 擠出機(jī)內(nèi)脫胚玉米可溶性糖沿螺桿的變化

對表5中可溶性糖含量進(jìn)行方差分析，如表6所示，處理?xiàng)l件中＜0.001，表明處理?xiàng)l件的變化對可溶性糖含量有極顯著的影響。取樣點(diǎn)的＜0.001，表明取樣點(diǎn)的不同對可溶性糖含量也有極顯著的影響。從值可以看出，處理?xiàng)l件對可溶性糖含量的影響明顯大于取樣點(diǎn)對可溶性糖含量的影響。進(jìn)行多重比較時發(fā)現(xiàn)，A樣品與B、C、D、E、F的值均小于0.001，有極顯著性差異。也就是說，擠出過程中酶的添加對可溶性糖的量產(chǎn)生了顯著影響。同時，還可以看出對可溶性糖的影響，C和E大于B和D，B和D又大于A和F，由此可以看出，糖化酶的加入對可溶性糖的影響較大。

表6 可溶性糖含量方差分析表

添加酶的種類不同，相同擠出條件下產(chǎn)生的可溶性糖差異較大，這與酶作用于淀粉的方式有關(guān)[17]，-淀粉酶屬內(nèi)切型淀粉酶，從淀粉分子內(nèi)部隨機(jī)作用于-1,4糖苷鍵，但水解位于分子中間糖苷鍵的概率遠(yuǎn)高于位于分子末端的-1,4糖苷鍵，在擠出機(jī)中較短的處理時間內(nèi)，水解出來的單糖、雙糖和低聚糖數(shù)量有限。而糖化酶水解淀粉時是從淀粉的非還原性末端依次水解-1,4糖苷鍵，切下葡萄糖單位，因此通過糖化酶的作用，擠出脫胚玉米中可溶性糖的含量明顯增加，但對總淀粉影響較小。普魯蘭酶只水解淀粉鏈分支點(diǎn)處的-1,6糖苷鍵，在擠出機(jī)內(nèi)作用較短時間的條件下，使可溶性糖含量增加的量相對少些。綜合來看，E樣品從1～6的擠出過程中可溶性糖含量增加最多，表明脫胚玉米中添加-淀粉酶+糖化酶+普魯蘭酶使淀粉降解的效果較好。擠出過程中，物料受到剪切力作用，首先剪切力破壞細(xì)胞壁[25]，隨后剪切力破壞淀粉顆粒、蛋白質(zhì)顆粒，同時，伴隨淀粉酶降解淀粉過程的進(jìn)行，也伴隨擠出過程中的部分淀粉酶失活[13]。已有研究表明，此時，剪切力僅使蛋白質(zhì)的粒徑以及疏水鍵和離子鍵的位置、狀態(tài)發(fā)生變化[26-27]，使它的水溶性、凝膠性、變性程度等發(fā)生變化，同時干法脫胚玉米中淀粉的含量、糊化度、可溶性糖等理化指標(biāo)均會發(fā)生變化。研究表明，主要是由于剪切力破壞脫胚玉米細(xì)胞壁，同時對淀粉顆粒和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生影響?？梢酝茰y，隨著剪切力破壞脫胚玉米細(xì)胞壁，細(xì)胞外面的水和酶制劑隨之進(jìn)入細(xì)胞中，在剪切力、熱、水、酶制劑的作用下，淀粉顆粒被降解，剪切力破壞細(xì)胞中的網(wǎng)狀蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

2.2 低溫?cái)D出過程中添加不同酶制劑對脫胚玉米籽粒細(xì)胞顯微組織結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 低溫?cái)D出過程中未添加酶制劑的脫胚玉米擠出過程的顯微切片分析

脫胚玉米經(jīng)擠出機(jī)處理，在擠出機(jī)套筒內(nèi)表面與螺桿外表面形成的腔體間物料受機(jī)械剪切力作用，植物組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)會受到一定程度的破壞，從圖2可以看出，喂料口處為原料脫胚玉米，A1中細(xì)胞緊密，結(jié)構(gòu)完整，在第一阻流環(huán)處（A2）脫胚玉米受到的機(jī)械剪切力作用較弱，細(xì)胞結(jié)構(gòu)有些破損，但尚不太明顯。而在第二阻流環(huán)處（A3）細(xì)胞結(jié)構(gòu)已出現(xiàn)明顯的破壞。在模孔內(nèi)側(cè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞程度進(jìn)一步加?。ˋ4、A5）。隨著脫胚玉米加入擠壓機(jī)到從?？着懦?，植物組織中規(guī)則網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量逐漸減少，原有組織狀態(tài)受到明顯破壞，植物細(xì)胞壁破裂，細(xì)胞內(nèi)的淀粉顆粒暴露出來，同時淀粉糊化度增大（見表3），條件適宜時更容易受到酶的作用。

玉米胚乳主要由蛋白質(zhì)基質(zhì)包埋的淀粉顆粒和細(xì)小蛋白顆粒組成。成熟的玉米胚乳由大量細(xì)胞組成，每個細(xì)胞都滿載著深埋在蛋白質(zhì)基質(zhì)中的淀粉團(tuán)粒，整個細(xì)胞內(nèi)容物的外面是纖維細(xì)胞壁[28-29]。生產(chǎn)中對脫胚玉米前期進(jìn)行預(yù)處理，就是采用一定的處理措施，破壞包含玉米淀粉顆粒的纖維細(xì)胞壁以及包裹著淀粉顆粒的蛋白質(zhì)基質(zhì)，盡可能多的將淀粉顆粒釋放出來，同時在水、酶、熱的作用下使淀粉吸水脹潤，天然晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，大分子打開，個別糖苷鍵斷裂，淀粉發(fā)生糊化，有利于進(jìn)一步對淀粉顆粒的水解作用。玉米胚乳經(jīng)擠出處理后，纖維細(xì)胞壁破裂，釋放出由蛋白質(zhì)基質(zhì)包埋的淀粉顆粒，部分淀粉發(fā)生降解。本試驗(yàn)通過顯微制片技術(shù)找到擠出處理可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)蒸煮糊化，用于發(fā)酵行業(yè)預(yù)處理工序的理論依據(jù)。

注：圖中的綠色和藍(lán)色線條代表細(xì)胞壁。

Note: The green and blue line in the picture represents the cell wall.

圖2 脫胚玉米細(xì)胞壁切片圖（100×）

Fig.2 Degermed corn cell wall section picture (100×)

圖3中A1~A6是不添加酶制劑脫胚玉米在擠出機(jī)中1～6的取樣點(diǎn)的樣品石蠟顯微切片，經(jīng)革蘭氏碘液對淀粉和蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，碘遇淀粉為藍(lán)色，遇蛋白質(zhì)染為棕黃色，然后在顯微鏡下觀察。從圖中可以看出，喂料口處為原料脫胚玉米，A1中細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，蛋白質(zhì)基質(zhì)包裹淀粉顆粒比較緊密，淀粉顆粒著色不明顯，整個顯微視野主要是蛋白質(zhì)呈現(xiàn)的黃色。在第一阻流環(huán)處（A2）脫胚玉米受到的機(jī)械作用力較弱，細(xì)胞結(jié)構(gòu)有些破損，部分淀粉顆粒溶出，染色后淀粉區(qū)域表現(xiàn)明顯。而在第二阻流環(huán)處（A3）細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)一步被破壞，淀粉區(qū)域互相連接，更加明顯。在模孔內(nèi)側(cè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞程度進(jìn)一步加?。ˋ4、A5），淀粉裸露，反過來包圍蛋白質(zhì)基質(zhì)。當(dāng)物料從?？着懦鰰r，由于減壓后產(chǎn)生的膨化作用使物料的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)一步破壞，從A6可以看出，細(xì)胞內(nèi)的淀粉顆粒完全暴露出來，淀粉聚集體中夾雜著一點(diǎn)蛋白質(zhì)基質(zhì)，淀粉從81.5%降低到74.4%（見表1），糊化度從20%上升到95.4%（見表3），均說明在擠出過程中脫胚玉米細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞，淀粉發(fā)生明顯變性，這一系列的變化都有利于酶制劑的作用。

2.2.2 低溫?cái)D出過程中添加不同酶制劑的脫胚玉米擠出物顯微切片分析

向脫胚玉米粉中添加-淀粉酶、糖化酶、普魯蘭酶及其組合，利用顯微切片觀察擠出后細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化（見圖2），添加的每一種酶制劑從擠出機(jī)中1～6點(diǎn)取樣，均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞由輕到重，圖2中C、D添加2種酶細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞程度與B添加1種酶相比，能明顯見到細(xì)胞壁破裂，淀粉顆粒存在于不完整的細(xì)胞中，表5中可溶性糖沿螺桿的變化情況也說明了這種現(xiàn)象。其中取樣點(diǎn)6處可溶性糖樣品C為14.71%，樣品D為8.29%，高于樣品B的7.9%；圖2中樣品E添加3種酶的作用擠出后對細(xì)胞壁破壞的更加嚴(yán)重，與添加2種酶相比，破損的細(xì)胞壁明顯增多，可以看到碎裂的細(xì)胞壁殘片，淀粉顆粒大部分游離出來。表1中樣品E擠出物淀粉含量降低到所有樣品中的最低值69.05%，表5中可溶性糖達(dá)到所有樣品中的最大值16.35%，都說明了3種酶同時作用的效果在所測試的樣品中是最好的。圖4為脫胚玉米擠出物細(xì)胞成分分布（40×）

注：圖中黃色為蛋白質(zhì)，藍(lán)色為淀粉，下同。

圖4 脫胚玉米擠出物細(xì)胞成分分布（40×）

脫胚玉米加入酶制劑以后進(jìn)行擠壓處理，從顯微切片上觀察蛋白質(zhì)和淀粉分布的變化，與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化趨勢相同，從圖4可以看出，經(jīng)擠壓處理后原脫胚玉米蛋白質(zhì)和淀粉的分布從圖3中A1的狀態(tài)發(fā)生變化，染色后藍(lán)色區(qū)域面積加大，添加2種酶的圖4中的C6、D6的細(xì)胞壁破壞，淀粉集聚，藍(lán)色面積中只有少量染成黃棕色的蛋白質(zhì)，而添加1種酶的圖4中B6和F6黃色面積較多，添加3種酶的圖4中E6幾乎都是藍(lán)色，淀粉著色明顯，細(xì)胞受到破壞較嚴(yán)重。從糊化度（表3）和可溶性糖（表5）的變化可以看出，加入1種酶（-淀粉酶）不如2種酶（-淀粉酶和糖化酶或者-淀粉酶和普魯蘭酶）在擠出過程中對淀粉的作用效果，而同時添加3種酶（-淀粉酶、糖化酶、普魯蘭酶）效果更加明顯。蛋白質(zhì)基質(zhì)結(jié)構(gòu)完全受到破壞，淀粉也已充分糊化。這種狀態(tài)下的淀粉更容易受到酶的作用。

2.2.3 低溫?cái)D出過程中添加中性蛋白酶的脫胚玉米擠出物顯微切片分析

由于玉米籽粒中胚乳部分淀粉顆粒外部包圍著蛋白質(zhì)基質(zhì)，為了提高在擠出過程中對蛋白質(zhì)基質(zhì)的破壞程度，考慮在擠出前添加中性蛋白酶，考察其對蛋白質(zhì)基質(zhì)酶解的效果，是否對淀粉的利用產(chǎn)生影響。添加中性蛋白酶后的擠出物如圖2中F、圖3中F所示。

從圖2中F、圖3中F可以看出，擠出前物料中加入中性蛋白酶對脫胚玉米胚乳中蛋白質(zhì)基質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)分布產(chǎn)生影響。其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，但程度較輕，仍保留原有的結(jié)構(gòu)分布，在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的壁面處可見小的裂痕，淀粉顆粒在細(xì)胞中心處變化不明顯。擠壓過程使蛋白質(zhì)分子內(nèi)疏水基暴露，蛋白質(zhì)交聯(lián)[30]，結(jié)合表1和表3的測定數(shù)據(jù)，可以看出添加中性蛋白酶后對胚乳中總淀粉降解影響不大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞有限，但淀粉已充分糊化。從表5的數(shù)據(jù)可以看出，添加3種淀粉酶的可溶性糖含量最高，達(dá)16.35%，而添加中性蛋白酶的只有6.43%。由此可見，擠出前是否添加蛋白酶對脫胚玉米原料中淀粉的利用沒有明顯的影響。

2.3 經(jīng)濟(jì)效益分析

低溫?cái)D出酶解干法脫胚玉米擠出物生產(chǎn)玉米淀粉糖漿技術(shù)，可應(yīng)用在葡萄糖、麥芽糖、果糖的生產(chǎn)中，還可以應(yīng)用在檸檬酸、谷氨酸等有機(jī)酸、氨基酸的生產(chǎn)中，現(xiàn)以生產(chǎn)檸檬酸為例，說明低溫?cái)D出酶解干法脫胚玉米擠出物代替玉米原糧生產(chǎn)檸檬酸的經(jīng)濟(jì)效益，本項(xiàng)目技術(shù)省去現(xiàn)有技術(shù)的噴射液化過程，使玉米原糧中的皮層、胚芽、胚乳等主要組分，經(jīng)分離分別使用，提高了玉米原糧主要組分的經(jīng)濟(jì)效益。試驗(yàn)結(jié)果表明，低溫?cái)D出加酶干法脫胚玉米擠出物可以代替玉米原糧生產(chǎn)檸檬酸，且省去現(xiàn)有技術(shù)的噴射液化過程，使淀粉轉(zhuǎn)化成葡萄糖的收得率提高至105%左右。初步分析表明：低溫?cái)D出加酶干法脫胚玉米擠出物生產(chǎn)檸檬酸與現(xiàn)有技術(shù)的玉米原糧生產(chǎn)檸檬酸相比，生產(chǎn)1 t檸檬酸，低溫?cái)D出加酶干法脫胚玉米擠出物比玉米原糧成本減少1 367.78元/t。然而，尚需進(jìn)行發(fā)酵罐試驗(yàn)和生產(chǎn)中試驗(yàn)證[31]。

3 結(jié) 論

1）對脫胚玉米擠出過程中總淀粉含量、糊化度、可溶性糖進(jìn)行測定，在擠出過程中，擠出物中大分子淀粉受到較強(qiáng)的機(jī)械剪切作用力，會有部分產(chǎn)生斷裂，淀粉發(fā)生糊化和降解，使表觀淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少，從81.50%減少到74.40%，可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，從1.07%增加到2.26%，擠出過程中加入酶制劑后這種效果更加明顯。其中以添加-淀粉酶、糖化酶、普魯蘭酶3種酶混合時變化最大，淀粉減少到69.05%，可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到16.35%。由此可見，3種酶（-淀粉酶、糖化酶、普魯蘭酶）協(xié)同作用對淀粉降解的效果以及可溶性糖含量的增加優(yōu)于單一酶（-淀粉酶）和2種酶（-淀粉酶+糖化酶，或者-淀粉酶+普魯蘭酶）的作用效果。

2）通過石蠟顯微切片技術(shù)，觀察低溫?cái)D出-多酶協(xié)同降解處理的脫胚玉米顯微切片，可以看出擠出過程中不加酶低溫?cái)D出脫胚玉米細(xì)胞結(jié)構(gòu)有明顯破壞，細(xì)胞內(nèi)淀粉顆粒大部分釋放出來，這也是通過擠壓技術(shù)使淀粉發(fā)生一系列變化的根本原因，有利于對淀粉的酶解處理。而擠出過程中添加酶制劑后脫胚玉米細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞的更加徹底。其中添加2種酶（-淀粉酶+糖化酶）優(yōu)于添加1種酶（-淀粉酶）的效果，但仍不如添加3種酶（-淀粉酶+糖化酶+普魯蘭酶）協(xié)同作用的效果。

3）擠出過程中，物料受到機(jī)械剪切力作用，首先剪切力破壞細(xì)胞壁，隨后剪切力破壞細(xì)胞中的淀粉顆粒、蛋白質(zhì)顆粒的粒徑，剪切力破壞細(xì)胞中的網(wǎng)狀蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，同時，伴隨淀粉酶降解淀粉的過程發(fā)生，部分淀粉酶也在失活，研究表明，此時，剪切力僅使蛋白質(zhì)的粒徑及疏水鍵和離子鍵的位置、狀態(tài)發(fā)生變化，使它的水溶性、凝膠性、變性程度等發(fā)生變化。前人和本文的試驗(yàn)結(jié)果表明：擠出過程中，剪切力破壞脫胚玉米細(xì)胞壁，以及細(xì)胞中的淀粉顆粒，在適量水的條件下，酶制劑降解淀粉，干法脫胚玉米中淀粉的含量、糊化度、可溶性糖等理化指標(biāo)均會發(fā)生變化，可見，隨著剪切力破壞脫胚玉米細(xì)胞壁，細(xì)胞外的水和酶制劑隨之進(jìn)入細(xì)胞中，在剪切力、水、酶制劑的作用下，淀粉顆粒被降解。

4）擠出前脫胚玉米中添加3種酶制劑擠出物的可溶性糖含量，明顯高于添加中性蛋白酶的可溶性糖的含量，可見，擠出過程中添加中性蛋白酶，對脫胚玉米胚乳中總淀粉降解影響不大，且細(xì)胞中蛋白基網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞有限。

致謝：感謝東北農(nóng)業(yè)大學(xué)李明教授在植物顯微技術(shù)方面給予的指導(dǎo)。感謝河北農(nóng)業(yè)大學(xué)、煙臺大學(xué)和山東理工大學(xué)為本論文的完成提供的支持和幫助。

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Ye Xiangku1,2, Shen Dechao3

(1.,,071001,; 2.,,264005,; 3.,,255091,)

In order to improve the conversion rate of starch to glucose, an enzyme (-amylase) was added to amylopectin by changing the-1,6-glycoside bond in amylopectin by extrusion enzymatic hydrolysis technology, and the microstructure of paraffin section was introduced. Low temperature (≤80 ℃) extrusion, multi-enzyme (-amylase, glucoamylase, pullulanase) synergistic degumming preparation. The distribution of protein granules and starch granules and the main physicochemical indexes of starch degradation in cells were observed. The results showed that starch content decreased from 81.50% to 74.40% and soluble sugar content increased from 1.07% to 2.26% during extrusion. The change of enzymatic extrusion process was more obvious. By adding-amylase, starch content decreased from 79.72% to 69.16%, soluble sugar content increased from 6.54% to 7.90%. By adding-amylase and glucoamylase, the starch content decreased from 81.42% to 72.45%, and the soluble sugar content increased from 11.65% to 14.71%. By adding-amylase and pullulanase, starch content decreased from 81.31% to 70.31%, soluble sugar content increased from 6.74% to 8.29%. By adding-amylase, glucoamylase and pullulanase, the starch content decreased from 81.06% to 69.05%, and the soluble sugar content increased from 11.25% to 16.35%. The results of microsection showed that the degradation degree of starch granules in the three enzymes was better than that of one (-amylase) or two enzymes (-amylase, glucoamylase or-amylase, pullulanase). The results showed that starch content decreased, soluble sugar content increased and gelatinization degree increased in degummed maize by low temperature enzymatic extrusion. At the same time, the effect of adding three enzymes (-amylase, glucoamylase and pullulanase) on starch degradation was better than adding one enzyme (-amylase) or two enzymes (-amylase, glucose- amylase or-amylase, pullulanase). These results provide useful data for improving starch utilization.

extrusion; enzyme; starch; degermed corn; cell structure; protein; physicochemical index

2019-01-04

2019-06-23

山東理工大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)4080-108001；橫向課題基金9194-10907701和淄博匯創(chuàng)生物科技有限公司提供的項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)資助。

葉向庫，博士生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品精深加工。Email：yexk@163.com

申德超，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品擠壓膨化工藝和設(shè)備的教學(xué)和科學(xué)研究。Email：shendc@126.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2019.14.036

TS210

A

1002-6819(2019)-14-0291-09

葉向庫，申德超. 低溫?cái)D出-多酶協(xié)同降解脫胚玉米中淀粉的機(jī)理[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2019，35(14)：291－299. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.14.036 http://www.tcsae.org

Ye Xiangku, Shen Dechao. Mechanism of starch degradation of corn grist degermed by extruded at low-temperature and multienzyme synergistic degradation[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2019, 35(14): 291－299. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.14.036 http://www.tcsae.org