近紅外光譜技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

◆作者：周冰谷花振新楊榮 林燕貞朱文亮

◆單位：1.精益和泰質(zhì)量檢測股份有限公司；2.廣東恒興飼料實業(yè)股份有限公司

據(jù)2006-2015年中國大陸地區(qū)食物中毒特征分析統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，“微生物性”食物中毒事件報導(dǎo)量以及導(dǎo)致食物中毒人數(shù)均位于首位。引起食物中毒的食品微生物多樣，傳統(tǒng)的微生物檢測方法主要為生化檢驗，操作程序繁雜，檢測周期長，易導(dǎo)致食品質(zhì)量和安全監(jiān)測滯后。較為先進的檢測方法有質(zhì)譜、核磁共振、基因芯片技術(shù)等，檢測成本相對較高。近紅外光譜技術(shù)具有無損、快速等優(yōu)點，在化工、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)境等領(lǐng)域發(fā)展極為迅速，它是目前世界上發(fā)展非?？焖俚姆治黾夹g(shù)之一，本文主要綜述近紅外光譜技術(shù)在食品微生物檢測應(yīng)用中的研究。

1 近紅外光譜技術(shù)

1.1 基本原理及特點

近紅外光譜區(qū)的波長范圍在780～2526nm，近紅外光譜是由分子振動的非諧振性使分子振動從基態(tài)向高能級躍遷時產(chǎn)生。近紅外光譜技術(shù)利用O-H、N-H、C-H等含氫基團化學鍵伸縮振動的倍頻及合頻吸收近紅外光特點，獲得樣本光譜中承載樣本的物理、化學、生物學信息，通過將采集樣本光譜和測量參比值結(jié)合化學計量方法，進行定標建模，實現(xiàn)對未知樣本參數(shù)的預(yù)測。

1.2 近紅外技術(shù)檢測微生物的過程

微生物由核酸、蛋白質(zhì)等化學成分組成，其成分對近紅光進行作用吸收，提供不同特性的光譜。微生物定標樣本的近紅外光譜包含結(jié)構(gòu)與組成等信息，其性質(zhì)參數(shù)與其結(jié)構(gòu)、組成具相關(guān)性。因此，樣本的光譜與性質(zhì)參數(shù)的測量值也一定具有相關(guān)性，應(yīng)用化學計量學方法對其進行關(guān)聯(lián)，確立兩者之間的定量或定性關(guān)系，完成模型后，僅需采集待預(yù)測樣本的近紅外光譜，再利用已經(jīng)建立的模型對待預(yù)測樣本的組成或性質(zhì)參數(shù)進行預(yù)測，即為定標建模和模型預(yù)測，如圖1。

2 在食品檢測中的應(yīng)用

2.1 食品中產(chǎn)毒真菌及其毒素的檢測

產(chǎn)毒真菌是指產(chǎn)生真菌毒素的真核細胞型微生物，其產(chǎn)生的毒素已經(jīng)鑒定有400多種，不同的真菌毒素具有不同毒性，能損傷體細胞、致畸、致癌。近紅外光譜技術(shù)可對食品中的產(chǎn)毒真菌進行有效預(yù)測監(jiān)控，以降低經(jīng)濟損失，保證食品安全。

據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織調(diào)查估算，全球每年受真菌毒素的污染的糧食約有25%，因污染嚴重而失去商業(yè)價值的農(nóng)作物約有2%。糧食品質(zhì)保證還需科學貯藏和檢驗監(jiān)控來護航，金昌福等（2016）應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)建立稻谷表面霉菌的定標模型可描述和預(yù)測稻谷表面霉菌總數(shù)在貯藏倉內(nèi)的變化規(guī)律。沈飛等（2018）建立的稻谷中的霉菌和菌落總數(shù)進行定標建模，模型可快速預(yù)測早期霉變稻谷中的菌落總數(shù)和鑒別感染不同霉菌及區(qū)分不同霉變程度的稻谷樣本。

圖1 近紅外光譜分析技術(shù)過程示意圖

果蔬的保鮮期常受到真菌影響。蘋果較其他種類更易被擴展青霉污染，擴展青霉素易導(dǎo)致肝臟和腎臟損傷。張亮（2010）應(yīng)用近紅外技術(shù)檢測建立蘋果中擴展青霉及蘋果汁中展青霉素的定標模型可進行定性和定量分析，能將蘋果在擴展青霉及其他不同霉菌、不同程度污染下，有效區(qū)分出擴展青霉，檢出限為：1.5×103個/mL；不同基質(zhì)中展青霉素的檢測限分別為：濃縮蘋果汁中為9.76μg/L；鮮榨蘋果汁中為 9.54μg/L；水溶液中為9.29μg/L。胡耀華等（2014）采用多元散射校正光譜預(yù)處理方法，通過多元線性回歸，建立的鮮棗內(nèi)酵母菌落總數(shù)的近紅外光譜模型，并結(jié)合鮮棗的近紅外光譜，建立了鮮棗光譜吸光度值與貯藏時間的動力學模型，可預(yù)測鮮棗在室溫下的安全貯藏期。

花生是人們喜愛堅果，也是我國重要油料經(jīng)濟作物。但它容易受到黃曲霉污染，部分黃曲霉菌產(chǎn)生毒素，其中黃曲霉毒素B1是一種極強的肝毒素，可引起肝臟急性中毒和癌癥。劉鵬等（2017）建立了五種黃曲霉產(chǎn)毒菌的定標模型，能快速檢測受霉菌污染的花生。

保健食品具有抗疲勞、提高免疫力等功效以輔助人體健康。蝙蝠蛾擬青霉和安絡(luò)小皮傘菌發(fā)酵菌粉中含多種類似蟲草成分。逯城宇（2017）采用近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合化學計量學方法，分別開展了它們中的蟲草酸、多糖、腺苷和蛋白質(zhì)含量同時快速檢測方法研究，模型的預(yù)測性能較好。紅曲菌也具有保健等價值，黃常毅（2014）采用氨基葡萄糖法測定生物量，應(yīng)用遺傳算法優(yōu)選光譜波段并建立了預(yù)測紅曲菌固態(tài)發(fā)酵生物量的定標模型，所建模型能夠?qū)崿F(xiàn)紅曲菌固態(tài)發(fā)酵生物量的快速檢測。

酵母在食品中的應(yīng)用非常廣泛，為保證酵母產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定需對其生產(chǎn)過程進行快速檢測監(jiān)控，王瑋等（2017）利用Antaris域型傅里葉變換近紅外光譜儀建立酵母菌定標建模,同時利用極限學習機（ELM）建立酵母菌生長過程4個階段的分類模型，應(yīng)用模型進行10次預(yù)測，其運行的訓(xùn)練集和測試集中的平均識別率分別為98.68%和97.37%。

2.2 食源性致病菌的檢測

致病菌廣泛存在我們的生活環(huán)境中。當人們食用被致病菌污染的食品時，人體可能會發(fā)生病變、中毒甚至突變、致癌等危害。國家相關(guān)標準對預(yù)包裝食品常監(jiān)控的致病菌有：單核細胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌。

岳田利等（2010）應(yīng)用傅里葉近紅外光譜技術(shù)可準確判別大腸埃希氏菌等六種標準菌株。劉建學等（2018）采用傅里葉變換近紅外光譜技術(shù)對未知樣本中3種食源性致病菌（大腸埃希氏菌O157∶H7、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌）進行預(yù)測判別，正確率均達到100%。在檢測方法探索過程中，也存在一些問題，馬凱旋（2018）采用近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合化學計量學方法對大腸埃希氏菌O157∶H7、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌以及這三種細菌混合培養(yǎng)作為第四類菌為研究對象，發(fā)現(xiàn)采集的致病菌近紅外譜圖受其濃度和培養(yǎng)時間影響較大，并干擾檢測結(jié)果，為近一步提高近紅外光譜技術(shù)在該領(lǐng)域的適用性提供了很好的參考作用。

近紅外光譜技術(shù)已應(yīng)用到牛奶中的致病菌檢測，王建明等（2016）利用傅里葉變換近紅外光譜技術(shù)采集被阪崎腸桿菌、金葡萄球菌、大腸桿菌三種致病菌污染的牛奶樣本，結(jié)合多元散射校正對光譜進行預(yù)處理，并結(jié)合偏最小二乘判別分析建立的定標模型，預(yù)測性能理想。

2.3 致食品腐敗的微生物檢測

食品的可食期受環(huán)境和微生物的影響較大，特別是生鮮農(nóng)產(chǎn)品等，具有易腐敗、季節(jié)性和地域性的特點，產(chǎn)后貯藏保鮮以及冷鏈物流等技術(shù)水平不足，腐敗變質(zhì)情況嚴重。研究表明，生鮮食品在化學、內(nèi)源酶及微生物作用下降低或失去營養(yǎng)和商品價值，由微生物引起的腐敗變質(zhì)是重要原因之一。

在掌握畜禽肉類貨架期方面，快速無損檢測方法凸顯優(yōu)勢，熊來怡（2012）通過零級模式動力學模型及主成分分析提取豬肉在室溫和冷藏溫下貯藏時的近紅外光譜特征值，分別建立菌落總數(shù)的動力學模型和其與近紅外光譜間的動力學模型。從而可利用近紅外光譜技術(shù)實現(xiàn)無損檢測豬肉的細菌菌落總數(shù)并預(yù)測其貯藏期。張累蕾等（2013）將可見光譜與近紅外光譜技術(shù)結(jié)合（400～1100 nm），對冷卻肉中菌落總數(shù)和顏色進行定標建模，所建定標模型能準確檢測冷卻肉細菌總數(shù)。郭中華等（2014）將近紅外高光譜圖像技術(shù)和化學計量方法結(jié)合研究了冷鮮羊肉表面的細菌總數(shù)的近紅外檢測方法，發(fā)現(xiàn)徑向基函數(shù)人工神經(jīng)網(wǎng)模型預(yù)測效果最好。雞肉加工過程中常受到蓋氏假單胞菌等的污染，影響雞肉品質(zhì)，陳全勝等（2017）應(yīng)用近紅外技術(shù)對污染蓋氏單胞菌的肌肉進行定標建模，其訓(xùn)練集和預(yù)測集的識率分別為99.17%和95.00%。

在水產(chǎn)品品質(zhì)檢測方面，段翠等（2014）以便攜式近紅外光譜儀為硬件，以牙鲆、鱸魚、三文魚為研究對象，將這三種分別各采集90組樣本光譜，結(jié)合樣本測量值進行定標建模，再用30組樣本數(shù)據(jù)用于模型驗證，20組實際樣本數(shù)據(jù)用于性能驗證，均取得良好效果。

雞蛋內(nèi)部品質(zhì)在無損檢測領(lǐng)域得到填補，趙楠等（2019）應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)對雞蛋內(nèi)部污染程度的可視化研究，根據(jù)雞蛋內(nèi)部污染程度及光譜特性的差異，建立了雞蛋內(nèi)部污染程度偽彩色圖像，采用支持向量機（SVM）結(jié)合樣本中菌落總數(shù)的光譜信息進行定標建模，模型能較好預(yù)測雞蛋中的菌落總數(shù)。

大腸菌群是評價食品質(zhì)量衛(wèi)生指標之一，劉建學等（2006）對原料乳中大腸菌群的測定原理與方法進行了研究，采用基于余弦相似度因子分析結(jié)合偏最小二乘回歸分析的近紅外光譜方法進行定標建模后進行模型預(yù)測，結(jié)果顯示預(yù)測模型顯著。

脂環(huán)酸芽孢桿菌等耐熱細菌是影響果汁生產(chǎn)的質(zhì)量安全的主要微生物，王若男等（2015）應(yīng)用傅里葉變換近紅外技術(shù)對脂環(huán)酸芽孢桿菌屬內(nèi)種間的7株不同的標準菌株進行定標建模，模型能100%準確判別標準菌類型。將上述建模的樣本混入分離菌后再次定標建模，對15個樣本進行預(yù)測以驗證模型的穩(wěn)健性和實用性，預(yù)測準確率為86.67%。

3 問題與建議

近紅外光譜技術(shù)的定標模型的建立面臨較多的問題。首先，需采集大量的樣本光譜與樣本的測量參比值，樣本量的多少、測量參比值的準確度直接影響到其定標模型代表性、穩(wěn)定性和準確性，前期定標建模需要耗費大量精力與時間；其次，近紅外檢測技術(shù)是一種間接測量技術(shù)，前期選擇樣本的代表性和測量參比值的準確性以及選擇合適計算模型非常重要，而且采集到不同類型的食品微生物的近紅外光譜信息特征各異，食品微生物種類繁多等；最后，在采集樣本的光譜過程中，樣本的基質(zhì)不同，其中混合其它微生物的種類和量不同均對其有干擾，影響模型的準確度和檢測限。這些問題導(dǎo)致定標建模困難，有待在這方面進行深入的研究。

要解決這些問題，可通過權(quán)威組織聯(lián)合進行共享資源，不僅能快速強大采集食品微生物的近紅外光譜和其對應(yīng)實測數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫，還降低人力、物力、財力、信息、時間等成本，實現(xiàn)參與者共贏。近紅外光譜區(qū)的波長范圍在780～2526nm之間，使得近紅外光譜技術(shù)在食品微生物檢測中存在一定的局限，可結(jié)合可見光光譜技術(shù)和遠紅外光譜技術(shù)等進行應(yīng)用，以改善弊端，擴大優(yōu)勢。

4 結(jié)語與展望

近紅外光譜檢測具有方便、快速、無損、多組分檢測準確和同時進行等優(yōu)點，適用領(lǐng)域眾多，具有廣闊的應(yīng)用前景。盡管其在前期定標建標階段投入成本較大，但這個成本與后期應(yīng)用時間長短成反比關(guān)系，從長遠來看，綜合成本持續(xù)下降的。相信在不久的未來，近紅外光譜技術(shù)在食品微生物快速檢測技術(shù)領(lǐng)域中占據(jù)越來越重要地位，促使食品微生物快速檢測技術(shù)領(lǐng)域邁上一個新的臺階。