鹽酸丁螺環(huán)酮大鼠在體腸吸收特征*

王柯玉，牟雄軍，林寧

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065)

鹽酸丁螺環(huán)酮(buspirone hydrochloride，BUS)為氮雜螺環(huán)癸烷二酮化合物，于1985年由德國(guó)Bristol-Myers上市，目前已在世界上很多國(guó)家廣泛使用。該藥物在臨床上主要用于廣泛性焦慮癥，還適用于更年期綜合征、抑郁癥、注意力缺乏、精神分裂癥等[1]。丁螺環(huán)酮作為新一代非苯二氮類抗焦慮藥，幾乎無(wú)依賴性與耐藥性，能長(zhǎng)期服用，且無(wú)鎮(zhèn)靜催眠作用，對(duì)認(rèn)知無(wú)影響，被認(rèn)為是較為理想的抗焦慮藥[2]。

BUS生物半衰期約2.6 h，血藥峰值濃度較低，目前市場(chǎng)上出售大多為普通片，其存在服藥次數(shù)多、順應(yīng)性差、生物利用度較低等問(wèn)題，因此開(kāi)發(fā)BUS緩釋、控釋制劑具有臨床應(yīng)用價(jià)值[3]。目前關(guān)于BUS腸道吸收及其機(jī)制研究的報(bào)道較少，研究藥物腸道吸收機(jī)制和吸收動(dòng)力學(xué)對(duì)于指導(dǎo)口服藥物的劑型設(shè)計(jì)，尤其對(duì)緩釋、控釋制劑的劑型設(shè)計(jì)具有重要意義。因此，本研究選用大鼠在體腸灌流法，采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定循環(huán)灌流液中BUS濃度，考察藥物在大鼠腸道的吸收動(dòng)力學(xué)特征，為BUS的緩釋、控釋制劑的研究與設(shè)計(jì)提供生物藥劑學(xué)依據(jù)[4]。

1 材料與儀器

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?SD)大鼠，雄性，體質(zhì)量(250±50)g，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2011-0009，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(鄂)2013-0072。動(dòng)物飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度18～35 ℃，相對(duì)濕度45%～75%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，手術(shù)前禁食12 h，自由飲水。

1.2試藥 BUS原料藥(上海玉博生物科技有限公司，批號(hào)：20150722，含量≥99.9%)；BUS對(duì)照品(原料藥精制，批號(hào)：201610)；酚紅(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150424)；戊巴比妥鈉(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，進(jìn)口分裝，批號(hào)：F20141216)；甲醇(色譜純，TEDIA)；乙腈(色譜純，TEDIA)；其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.3儀器 戴安P680高效液相色譜儀(美國(guó)戴安)；UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津)；BP211D電子天平(德國(guó)賽多利斯天平有限公司，感量：0.01 mg)；HL-2恒流泵(上海滬西分析儀器廠)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；SK2200H型超聲波清洗儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1腸循環(huán)液中BUS的含量測(cè)定

2.1.1溶液的配制 K氏緩沖液的制備：稱取氯化鈣0.37 g、葡萄糖1.40 g，置燒杯中，用適量水溶解；再稱取氯化鈉7.8 g、氯化鉀0.35 g、氯化鎂0.22 g、碳酸氫鈉1.37 g、磷酸二氫鈉0.32 g，依次加入另一燒杯中溶解；二者混合并定容至1 000 mL，測(cè)得pH值為7.4?？瞻啄c循環(huán)液的制備：將配置好K氏液經(jīng)腸循環(huán)裝置，以5.0 mL·min-1流速?zèng)_洗大鼠腸道約45 min，收集，濾過(guò)，即得空白腸循環(huán)液。對(duì)照品溶液的制備：精密稱取BUS對(duì)照品適量，用空白腸循環(huán)液溶解并定容，配制成含BUS濃度為0.101 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備：精密稱取BUS和酚紅適量，用空白腸循環(huán)液溶解并定容，配制成BUS濃度為20.12 μg·mL-1，酚紅濃度為20.07 μg·mL-1的混合供試品溶液。

2.1.2色譜條件 色譜柱：Agilent SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-1%甲酸(40：60)；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.3系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 按照“2.1.2”項(xiàng)色譜條件，取對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白腸循環(huán)液進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖1，BUS保留時(shí)間為6.33 min，樣品液主峰保留時(shí)間與對(duì)照品一致；空白腸循環(huán)液在BUS出峰處無(wú)干擾；供試品的分離度不少于1.5，理論板數(shù)不少于5 000。

2.1.4線性關(guān)系與方法學(xué)考察 精 密量取BUS對(duì)照品溶液適量，配制成4.04，8.08，12.12，16.16，20.20，30.30 μg·mL-1系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，于上述色譜條件下分別進(jìn)行HPLC測(cè)定；以峰面積(A)對(duì)BUS濃度(C，μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=0.049 9C+0.007 3(R2=0.999 1)；BUS在4.04～30.30 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度的線性關(guān)系良好。精密度實(shí)驗(yàn)中日內(nèi)RSD=0.52%(n=5)，日間RSD=0.84%(n=3)；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中將BUS對(duì)照品溶液室溫放置24 h，其峰面積RSD=1.54%(n=5)，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，BUS穩(wěn)定性良好；加樣回收率實(shí)驗(yàn)中配置濃度為20.12 μg·mL-1的BUS標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)溶液含量80%，100%，120%的樣品，測(cè)定BUS的濃度，其平均回收率為99.73%，RSD=1.12%(n=3)；均符合要求[5-7]。

1.鹽酸丁螺環(huán)酮

2.2腸循環(huán)液中酚紅濃度的測(cè)定

2.2.1測(cè)定方法 采用可見(jiàn)-紫外分光光度法測(cè)定腸循環(huán)液中酚紅的濃度。在波長(zhǎng)200～600 nm范圍進(jìn)行紫外掃描，酚紅在558 nm處有最大吸收，其他成分在此處無(wú)吸收，對(duì)酚紅無(wú)干擾，故在波長(zhǎng)558 nm處測(cè)定酚紅的吸光度(A值)。

2.2.2酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取酚紅適量，配制濃度為5.03，10.06，20.12，30.18，35.21 μg·mL-1的酚紅系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取酚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL置于10 mL具塞試管中，加入0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液 5 mL，搖勻，用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液，以0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液為空白，在波長(zhǎng)558 nm處測(cè)定，以A值對(duì)酚紅濃度(C，μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=0.009 8C+0.038 1(R2=0.999 7)。結(jié)果表明，酚紅在濃度范圍5.03～35.21 μg·mL-1內(nèi)有良好的線性關(guān)系[8]。精密度實(shí)驗(yàn)中日內(nèi)RSD=0.43%(n=5)，日間RSD=0.75%(n=3)；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中將酚紅溶液室溫放置24 h，其峰面積RSD=1.32%(n=5)，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，酚紅穩(wěn)定性良好；加樣回收率實(shí)驗(yàn)中配置濃度為20.07 μg·mL-1的酚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)溶液含量80%，100%，120%的樣品，測(cè)定酚紅的濃度，其平均回收率為99.52%，RSD=1.26%(n=3)；均符合要求。

2.3大鼠在體腸道吸收實(shí)驗(yàn)

2.3.1腸道吸收實(shí)驗(yàn)方法 大鼠禁食、正常飲水18～20 h；麻醉，背位固定在手術(shù)臺(tái)上，沿腹中線剪開(kāi)腹腔；選取所需腸段，兩端剪口，插管扎緊；用預(yù)熱至37 ℃的0.9%氯化鈉溶液沖洗腸道，再通入空氣排凈0.9%氯化鈉溶液[9]。先用BUS供試品溶液以5 mL·min-1的流速循環(huán)10 min，然后將流速調(diào)節(jié)為2.5 mL·min-1；分別于不同時(shí)間點(diǎn)從供試液中分別取2和0.5 mL作為BUS和酚紅的待測(cè)液，隨即補(bǔ)充同濃度酚紅供試品溶液2.5 mL；按上述方法測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)BUS峰面積值(采用外標(biāo)法)和酚紅吸光度值，按文獻(xiàn)方法計(jì)算吸收速率常數(shù)(Ka)和吸收百分率(ρ)[10-11]。

2.3.2不同腸段對(duì)藥物在體腸吸收的影響 將十二指腸、空腸、回腸及結(jié)腸作為考察腸段，取含BUS濃度為20.12 μg·mL-1、酚紅濃度為20.07 μg·mL-1的供試品溶液。按“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，于0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 h取樣，計(jì)算吸收參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及兩兩間多重比較，結(jié)果顯示不同腸段Ka差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各腸段吸收速率常數(shù)按十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的順序依次下降。十二指腸為藥物最佳吸收部位，但藥物在整個(gè)腸段均有一定吸收。

表1 鹽酸丁螺環(huán)酮在大鼠各腸段吸收參數(shù)

2.3.3不同濃度對(duì)藥物在體腸吸收的影響 選取全腸段為考察腸段，取含BUS濃度分別為10.06，20.12，30.18 μg·mL-1、酚紅濃度為20.07 μg·mL-1的供試品溶液。按“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，于0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 h取樣，計(jì)算其吸收參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)Ka進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果表示在不同藥物濃度下，吸收速率常數(shù)Ka差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明濃度在10.06～30.18 μg·mL-1，藥物的吸收量與濃度成正比，Ka無(wú)明顯變化，無(wú)飽和吸附現(xiàn)象，符合Ficks擴(kuò)散原理，提示BUS的小腸吸收為被動(dòng)擴(kuò)散的機(jī)制。

表2 不同濃度鹽酸丁螺環(huán)酮小腸吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.4pH值對(duì)藥物在體腸吸收的影響 選取吸收速率常數(shù)最大的十二指腸，用pH值為5.4，6.8，7.4的K氏液分別配制含BUS濃度為20.12 μg·mL-1、酚紅濃度為20.07 μg·mL-1的供試品溶液。按“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，于0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 h取樣，計(jì)算其吸收參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)Ka進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果表示在不同環(huán)境pH值下，吸收速率常數(shù)Ka差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明在pH值5.4～7.4范圍內(nèi)，BUS的吸收不受介質(zhì)pH值的影響。

表3 不同pH值下鹽酸丁螺環(huán)酮小腸吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

在體腸循環(huán)法研究大鼠腸道吸收情況，通常認(rèn)為大鼠腸道不僅吸收藥物，同時(shí)也可能吸收或排出水分，所以在循環(huán)時(shí)會(huì)導(dǎo)致供試品溶液體積的改變[12]。一般可在循環(huán)液中加入酚紅，由于酚紅為大分子絡(luò)合物，較難被腸道所吸收，因此可通過(guò)酚紅濃度的變化來(lái)對(duì)腸循環(huán)液體積進(jìn)行校正，即得不同時(shí)刻的剩余藥量[13]。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，以循環(huán)液中BUS剩余藥量的對(duì)數(shù)lgD對(duì)時(shí)間t作線性回歸，所得相關(guān)系數(shù)r均大于0.9，線性關(guān)系較好，提示BUS在大鼠小腸的吸收符合表觀一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程，吸收以被動(dòng)擴(kuò)散為主；且BUS的吸收不受藥物濃度和pH值的影響；大鼠各腸段間藥物的吸收速率常數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，按十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸依次減小，但藥物在整個(gè)腸段均有一定程度的吸收，提示鹽酸丁螺環(huán)酮可以制備緩釋、控釋制劑[14-15]。