MIP-1α、DFR對老年臥床靜脈血栓栓塞癥的預(yù)測價值

田丁元，黨連生

靜脈血栓栓塞癥（venous thromboembolism，VTE）包括深靜脈血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）和肺血栓栓塞癥（pulmonary thromboembolism，PTE），是同一疾病的兩個不同階段，具有高漏診率、高病死率、易復(fù)發(fā)等特點［1］。臨床上，DVT來源的栓子被認為是發(fā)生PTE 的主要因素，且未經(jīng)治療的DVT極易發(fā)生PTE，因此，預(yù)防致命性肺栓塞的根本途徑是提高隱匿性DVT的早期診斷率［2］?！斗窝ㄋㄈY診治與預(yù)防指南》（以下簡稱《指南》）指出無論是內(nèi)科住院患者還是外科手術(shù)患者，發(fā)生VTE 的風(fēng)險均高達40%～60%［3］，并且多數(shù)患者因癥狀不典型易出現(xiàn)漏診、誤診的情況，給患者的生活質(zhì)量帶來了巨大的危害［4］，因此找到一種快速便捷的方法預(yù)測VTE 的發(fā)生顯得尤為重要?！吨改稀愤€指出對于低中?？梢蒝TE 患者應(yīng)行D-二聚體檢測以指導(dǎo)下一步診療，50歲以上患者采取年齡校正后D-二聚體作為輔助診斷指標。有研究指出D-二聚體/纖維蛋白原（D-dimer fibrinogen ratio，DFR）診斷VTE 的特異性優(yōu)于D-二聚體［5］，但其在老年VTE患者中的診斷意義尚不明確。巨噬細胞炎性蛋白因子-1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）是由巨噬細胞、樹突細胞等多種細胞分泌的促炎性趨化因子［6］，具有炎癥和免疫調(diào)節(jié)活性。有研究發(fā)現(xiàn)MIP-1α可能參與深靜脈血栓的形成和溶解過程，主要通過炎癥反應(yīng)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［7］。但MIP-1α 與老年臥床VTE的相關(guān)研究尚少見。本研究旨在探討MIP-1α和DFR對DVT和PTE的預(yù)測價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2017 年6 月—2018 年6 月于我院就診疑似VTE 的老年患者為研究對象。納入標準：（1）Padua 評分≥4分［8］。（2）近1個月未應(yīng)用抗凝藥物。（3）年齡≥65歲。（4）臥床≥3 d。排除標準：（1）近1年發(fā)生過急性冠脈綜合征。（2）慢性腎衰患者，肌酐＞180 μmol/L。（3）近1 個月有急性感染（重癥感染或感染中毒癥）、創(chuàng)傷或手術(shù)治療。（4）合并嚴重凝血功能障礙及肝功能損害。（5）既往靜脈血栓癥。（6）已知具有易栓傾向的病例，如抗凝血蛋白C、蛋白S 和抗凝血酶缺乏，凝血因子V 萊頓（leiden）突變、凝血酶原G20210A 突變，抗心磷脂綜合征。按上述標準最終納入129例患者，其中男59 例，女70 例，平均（75.48±7.21）歲。對所有患者行下肢加壓超聲（CUS）檢查，高度可疑PTE的患者進一步行CT肺血管造影（CTPA），根據(jù)檢查結(jié)果將患者分為非DVT 組74 例，單純DVT 組34 例，PTE 組21 例。非DVT 組：給予對癥治療；DVT組及PTE組：給予低分子肝素、華法林抗凝治療，監(jiān)測國際標準化比值（international normalized ratio，INR），調(diào)整藥物劑量。本研究已獲醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 實驗室指標檢測 在抗凝治療前采集患者新鮮血液標本，收集實驗室指標：白細胞（WBC）、中性粒細胞（N）、淋巴細胞（L）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、凝血酶原時間（PT）、部分活化凝血活酶時間（APTT），上述指標的檢測均在我院檢驗科完成，檢測過程在質(zhì)控合格情況下進行，并計算中性粒細胞計數(shù)/淋巴細胞計數(shù)比值（neutrophil lymphocyte ratio，NLR）。

1.2.2 D-二聚體、纖維蛋白原（FIB）、MIP-1α 水平檢測 于抗凝治療前采集患者靜脈血液標本，采用免疫比濁法測定血漿D-二聚體水平，凝固法測定血漿纖維蛋白原水平，D-二聚體測定試劑盒、纖維蛋白原測定試劑盒購自上海太陽生物技術(shù)有限公司，于全自動凝血功能檢測儀上進行檢測，計算DFR。

采用巨噬細胞炎性蛋白-1α（MIP-1α/CCL3）ELISA 試劑盒（酶免公司）測定血清MIP-1α的水平。根據(jù)結(jié)果繪制標準曲線，得出直線方程，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品的實際濃度。并計算年齡校正后D-二聚體（Age-adjusted D-dimer）=D-二聚體/（年齡/50）mg/L。比較各組間指標的差異，并通過受試者工作特征（ROC）曲線評價診斷效能。

1.2.3 Real-time PCR 檢測MIP-1α mRNA 表達量 （1）引物序列。內(nèi)參基因GAPDH：上游5′-ACGACCACTTTGTCAAGCTC-3′，下游5′-GAGGAGGGGAGATTCAGTGT-3′，擴增產(chǎn)物長度208 bp；目的基因MIP-1α：上游5′-ACCTCCACAGCTACCTCTT-3′，下游5′-GATCACAGCCCTGAACAA-3′，擴增產(chǎn)物長度292 bp。（2）總RNA 的提取。采用Trizol 法提取總RNA，提取的總RNA經(jīng)凝膠電泳檢測完整性，用紫外分光光度計進行RNA 純度的檢測，純度合格的總RNA 溶液其OD260/OD280值在1.8～2.0之間，合格的用于逆轉(zhuǎn)錄；cDNA合成：用4 μL RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，嚴格按照寶生物工程（大連）有限公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Primer Script-RT reagent Kit（Perfect Real Time）說明書操作，反應(yīng)體系為10 μL；熒光定量PCR：使用SLAN-96S 型Real Time PCR 儀，嚴格按照TB Green?Premix Ex Taq ?Ⅱ試劑盒寶生物工程（大連）有限公司說明書進行操作，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40個循環(huán)，每個樣本設(shè)置3個檢測復(fù)孔，以2-ΔΔCt值代表樣本中MIP-1α mRNA的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，3組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，3組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間多重比較行Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。應(yīng)用ROC 曲線下面積（AUC）評價老年VTE 患者各項指標預(yù)測價值，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組一般資料比較 3組性別比例、年齡、慢性心功能不全、高血壓史、糖尿病史、PT、CRP、WBC、NLR、APTT差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 3組D-二聚體、校正D-二聚體、纖維蛋白原、DFR 水平的比較 PTE 組、DVT 組D-二聚體、校正后D-二聚體、DFR 水平均顯著高于非DVT 組（P＜0.05），PTE組與DVT組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；3組纖維蛋白原差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

2.3 3組間MIP-1α水平及MIP-1α mRNA表達量的比較 DVT組、PTE組血清MIP-1α水平高于非DVT組，PTE組血清MIP-1α水平低于DVT組（P＜0.05）。DVT組、PTE組MIP-1α mRNA的相對表達量均高于非DVT組（P＜0.05），見表3。

2.4 各項指標診斷VTE 的預(yù)測價值 DFR、MIP-1α、校正后D-二聚體對VTE 的診斷均有診斷價值（P＜0.05），校正后D-二聚體對老年患者VTE 的診斷效能最高，DFR 的診斷效能與傳統(tǒng)D-二聚體相當；MIP-1α 對VTE 的診斷價值為中等價值，其對VTE的預(yù)測能力一般。NLR對VTE的診斷無預(yù)測價值（P＞0.05），見圖1、表4。

Fig.1 Receiver operating characteristic(ROC)curves of indicators圖1 各項指標的ROC曲線

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)炎癥與血栓形成密切相關(guān)［9］。炎癥可增加促凝血因子的生成，抑制天然抗凝血途徑和纖維蛋白溶解活性，導(dǎo)致血栓形成。凝血過程也會通過凝血酶誘導(dǎo)促炎細胞因子和生長因子的分泌增加炎癥反應(yīng)的強度，導(dǎo)致惡性循環(huán)［10］。越來越多的證據(jù)表明，炎癥是VTE發(fā)生的病理生理學(xué)因素［11］。

MIP-1α是趨化因子C-C家族成員，主要由巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞、成纖維細胞等分泌，其通過特異性地結(jié)合受體繼而趨化淋巴細胞、單核細胞向炎癥、損傷部位遷移，促進損傷部位的自我修復(fù)而發(fā)揮作用［12-13］。MIP-1α 的表達還可提高中性粒細胞的浸潤程度，促進炎性因子的釋放并增加炎癥因子對上皮細胞的促凋亡作用［14］，還具有促進膠原纖維蛋白的合成，加劇上皮組織增生和纖維化程度，募集炎性細胞，促使傷口愈合的生物學(xué)功能［15］。MIP-1α 在多種炎癥性疾病的發(fā)病過程中起著重要作用。有研究顯示，MIP-1α可能通過誘導(dǎo)炎性因子釋放激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮作用，其可能是預(yù)測急性胰腺炎嚴重程度的生物學(xué)標志物［16］；MIP-1α還可作為反映腦外傷嚴重程度的客觀指標，其可能通過結(jié)合受體刺激炎性因子產(chǎn)生向創(chuàng)傷病灶積聚而加劇局部損傷［17］；血漿MIP-1α 是動脈粥樣硬化發(fā)生的獨立危險因素，其發(fā)生機制可能為誘導(dǎo)炎性細胞活化參與血管內(nèi)皮損傷，從而參與冠心病動脈硬化病理過程［18］。MIP-1α 不僅在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，在血栓形成中也存在一定的生物學(xué)效應(yīng)。Chen等［19］研究發(fā)現(xiàn)在小鼠DVT造模后3 d血栓栓子中單核巨噬細胞顯著升高，且MIP-1α在栓子中呈逐漸升高趨勢，提示MIP-1α可能通過作用于單核巨噬細胞而參與DVT 過程。劉海平等［7］通過建立小鼠DVT 模型觀察血栓形成后MIP-1α 與血栓栓子溶解的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MIP-1α 在DVT 形成后可通過趨化巨噬細胞向靜脈血栓處聚集而促進血栓溶解，其中和抗體具有阻斷MIP-1α 促進血栓溶解的作用。本研究結(jié)果顯示，老年VTE 患者血清MIP-1α 水平及其mRNA 相對表達量在PTE 組及DVT 組中均高于非DVT 組，與以往研究結(jié)果一致［20-21］，提示MIP-1α 可能是靜脈血栓形成及不穩(wěn)定脫落的標志物，主要通過炎癥反應(yīng)參與疾病的發(fā)生發(fā)展。

Tab.1 Comparison of general data between three groups表1 3組間一般資料比較

Tab.2 Comparison of plasma levels of D-dimer,corrected D-dimer,fibrinogen and DFR between three groups表2 3組D-二聚體、校正D-二聚體、纖維蛋白原、DFR水平的比較［M（P25，P75）］

Tab.3 Comparison of serum levels of MIP-1α and MIP-1α mRNA expressions between three groups表3 3組血清MIP-1α水平與MIP-1α mRNA表達量的比較

Tab.4 Analysis of receiver operating curves of various indicators for the diagnostic value of VTE表4 各項指標對VTE診斷價值的ROC曲線分析

NLR 是臨床常見的炎性標志物，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程，其也被視為機體血栓形成的標志物，尤其在心血管疾病的病理生理過程中起重要作用［22］。D-二聚體是纖維蛋白原交聯(lián)時的降解產(chǎn)物，來源于靜脈血栓纖維基質(zhì)的降解，是反映凝血激活及繼發(fā)性纖溶的特異性分子標志物［23］，纖維蛋白原升高是血栓形成的前提，在凝血酶的作用下降解為纖維蛋白，繼而相互交聯(lián)形成血栓，同時激活纖維蛋白溶解系統(tǒng)，因而D-二聚體可以作為纖溶指標，纖維蛋白原可作為凝血指標，DFR即反映纖溶/凝血過程的平衡［24］。有研究表明PTE 可能會使D-二聚體升高而降低纖維蛋白原，在診斷PTE 時DFR 可能具有與D-二聚體相同的重要性［24］。本研究結(jié)果顯示，MIP-1α對VTE的預(yù)測價值不及傳統(tǒng)D-二聚體的診斷效能；校正年齡后D-二聚體、DFR 對VTE 的預(yù)測價值高于傳統(tǒng)D-二聚體，為中等強度；NLR 對VTE無診斷價值，提示對于老年患者VTE 的診斷，校正D-二聚體、DFR更有意義。