馬尾松種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD 分析

侯曉奎 李元應

（黃河交通學院，河南 武陟 454950）

馬尾松是我國重要的用材和綠化樹種之一，其遺傳多樣性是良種選繁的基因基礎。因此，對馬尾松種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究具有非常重要的現(xiàn)實意義。

1 目的和意義

擬采用RAPD 標記技術，分析和研究了35 份不同地域和緯度的馬尾松種源遺傳變異情況和數(shù)據(jù)，為馬尾松核心種質(zhì)資源庫的建立奠定良好的物質(zhì)基礎，對馬尾松種質(zhì)資源的保護與可持續(xù)開發(fā)利用，具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

2 材料與方法

2.1 材料

供試驗的35 份馬尾松種質(zhì)資源材料，全部來自三明市大田縣桃源國有林場試驗基地。2018 年3 月，從林場種質(zhì)資源試驗基地中，每個種源抽選5 株，采集剛抽生的嫩梢，冷藏于-20℃冰箱中保存，供提取其DNA 使用。

2.2 儀器與試劑

RAPD 引物選用生工生物工程（上海）有限公司的S 系列引物，TaqDNA 聚合酶、dNTPs（dNTP Mix）購自深圳市基因谷科技有限公司；PCR 擴增儀為M J Reareh PTC-200，電泳儀為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-Ⅱ型，凝膠成像系統(tǒng)為Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)。

2.3 方法

2.3.1 DNA 提取與檢測。采用CTAB 法提取DNA，從提取的DNA 樣品中取出10μL，稀釋到1000μL，然后在UV-7504型紫外分光光度計檢測DNA 的純度、濃度和產(chǎn)率，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量。

2.3.2 RAPD-PCR 擴增反應與優(yōu)化。RAPD-PCR 擴增反應體系25μL，內(nèi)含50ng 模板DNA，2.0mmol/LMgCl2，0.8μmol/L引物，0.25mmol/LdNTPs，1UTaqDNA 聚合酶，1×buffer 緩沖液。再選擇一個基本擴增程序：94℃預變性5min；94℃變性1min，36.5℃退火1min，72℃延伸2 min，45 個循環(huán)；72℃延伸7 min，退出。

隨機抽取同樣株的DNA 為模板，以TaqDNA 聚合酶、引物濃度、DNA 模板濃度、Mg2+濃度、dNTP 濃度為優(yōu)化因子，分別設置不同的梯度，S91（5'-TGCCCGTCGT-3'）作為本優(yōu)化試驗的引物。優(yōu)化時保持基本擴增體系不變，在基本擴增程序上，每次只改變1 個擴增參數(shù)進行擴增。擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠于3V/cm 電場中電泳，染色，觀察、記錄、分析并拍照。

2.3.3 RAPD-PCR 擴增反應引物篩選。選擇差異性較大的3份DNA 樣品，以前面篩選出的RAPD 擴增程序和擴增體系，用所選購的200 條隨機引物進行RAPD 擴增試驗，從中篩選出擴增條帶清晰、重復性高的引物用于馬尾松種質(zhì)資源的RAPD 分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 RAPD-PCR 最佳反應體系與反應程序確立

通過篩選TaqDNA 聚合酶用量、引物濃度、模板DNA 濃度、Mg2+濃度、dNTPs 濃度等因子，RAPD-PCR 較為理想的擴增體系為：在擴增反應總體積25μL 中，包含25ng 模板DNA，2.5mmol/LMgCl2，0.8μmol/L 引 物，0.16mmol/L dNTP，1.0UTaqDNA 聚合酶，1×Buffer 緩沖液。通過優(yōu)化熱循環(huán)參數(shù)，較為理想的擴增程序為：94℃預變性5min；94℃變性1 min，37℃退火1 min，72℃延伸2 min，45 個循環(huán)；72℃延伸7 min 退出。

3.2 擴增結(jié)果統(tǒng)計及譜帶分析

用前面優(yōu)化出的RAPD 反應條件，從需要分析的樣品中抽取3 份DNA 樣品作為模板，對S 系列的200 條隨機引物進行PCR 擴增試驗。從該200 條隨機引物中篩選出了18 個可用于馬尾松RAPD 分析的隨機引物。引物號及序列見表1。

經(jīng)過統(tǒng)計，用篩選出來的18 個RAPD 引物對35 份馬尾松樣品進行擴增試驗，共檢測到153 個條帶，其中多態(tài)位點為137 個，多態(tài)位點百分率為89.5%。每個引物檢測到的條帶數(shù)介于4～17 條，平均每個引物為8.5 條，不同引物的擴增片段長度在300～3800bp。其中擴增位點最多的是S66，S91和S150，分別擴增出的位點數(shù)為17，15 和15。擴增位點最少的是S65 和S141，僅擴增出4 條清晰的條帶。這證明了RAPD 可以準確檢測出馬尾松種質(zhì)資源的遺傳多樣性。引物S66 的RAPD 擴增譜帶（如圖1）。

圖1 RAPD 標記中S66 號引物擴增出來的DNA 譜帶

表1 RAPD 分析所用引物及其擴增譜帶數(shù)

3.3 遺傳多樣性分析

在對不同引物的擴增產(chǎn)物試驗過程中，僅有個別品種或單株在其某一片段長度處（位點）有條帶出現(xiàn)，這種其他品種或單株所不具備的條帶，可作為該品種或單株的特殊RAPD標記。本試驗共獲得8 條引物的共13 條RAPD 特異帶（見表2），這些標記是某一品種或單株的特有條帶，是進行特殊性狀標記的基礎。通過比較條帶存在與否、條帶的多少及帶型的差異可發(fā)現(xiàn)不同品種或單株之間的差異、遺傳多樣性和親緣關系。

利用SPSS11.5 的聚類分析功能分析35 份樣品的RAPD擴增所得到的譜帶數(shù)矩陣，計算各樣品間的遺傳相似系數(shù)（GS），從遺傳相似系數(shù)來看，馬尾松種質(zhì)資源遺傳多樣性較為豐富。35 份供試樣品兩兩之間的GS 值在0～1，平均為0.494。其中福建三明和福建閩清之間的遺傳相似系數(shù)最大，為1，說明兩者之間的遺傳基礎相似，親緣關系非常接近。安徽屯溪與安徽潛山、廣西忻城與福建武平、湖南江永與江西靖江、湖北紅安與湖南常寧兩兩之間的相似系數(shù)分別為0.981、0.960、0.929、0.921，均高于0.92，說明二者在基因組組成和核苷酸序列上極為相似。而四川南江與江西靖江遺傳相似系數(shù)最小，為0，即遺傳距離為1，表明它們之間的親緣關系最遠。同時福建邵武與其它34 份樣品的遺傳相似系數(shù)均在低于0.352，且僅與3 個樣品大于0.3，說明與其它樣品間的差異最明顯。

表2 RAPD 擴增的特異引物和特異標記

4 結(jié)論與討論

從篩選出來的18 個RAPD 引物對35 份馬尾松種質(zhì)資源進行了DNA 擴增試驗，共檢測到153 條RAPD 標記條帶，其中多態(tài)性帶137 條，多態(tài)性百分率為89.5%，不同引物的擴增片斷長度在300～3800bp，平均每個引物檢測到的條帶數(shù)為8.5 條。不同引物的擴增片斷的數(shù)目及其多態(tài)性程度均不同，但都呈現(xiàn)出了豐富的多態(tài)性，證明了RAPD 可以準確檢測馬尾松種質(zhì)資源的遺傳多樣性。采用聚類分析發(fā)現(xiàn)遺傳關系，僅由種質(zhì)材料來源區(qū)域的遠近和生產(chǎn)上品種的名稱判斷很難得到準確信息。

因此，只有借助于各種新的分子層級水平的檢測手段才能取得更加有效、更加準確的分析和評估，為資源保護利用和育種選繁實踐提供有力的支撐。鑒于RAPD 標記存在一定的局限性，下一步應逐步嘗試使用其他的分子標記技術手段，如ISSR、AFLP 進行更深層次的分析。