基于納米金-羅丹明B體系熒光增強(qiáng)檢測(cè)阿米卡星

王 睿，田 銳，劉航航，張美琪，何思媛

(延安大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院；延安市分析技術(shù)與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 延安 716000)

阿米卡星(Amikacin)，是一種氨基糖苷類抗生素，在臨床上主要用于治療多種耐藥菌感染，由于阿米卡星有一定毒副作用，因此對(duì)其用量要有嚴(yán)格的控制，采取合適的方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)也尤為重要[1]。由于阿米卡星自身無特征紫外吸收，所以不能直接采用傳統(tǒng)HPLC(紫外)進(jìn)行檢測(cè)，《中國藥典》2010年版二部[2]規(guī)定采用HPLC-柱前衍生化法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定阿米卡星的方法有：旋光法、液相色譜-質(zhì)譜法、光度法、電化學(xué)法、化學(xué)發(fā)光分析法、熒光法等[3-8]。熒光分析法由于儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、測(cè)定靈敏度高而在分析檢測(cè)中備受關(guān)注，但文獻(xiàn)報(bào)道的熒光分析法存在熒光探針制備復(fù)雜、絡(luò)合物穩(wěn)定性差等問題，因此，發(fā)展新的簡(jiǎn)單穩(wěn)定的熒光分析法具有重要意義。

金納米粒子(納米金，AuNPs)具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，當(dāng)納米金與熒光物質(zhì)作用時(shí)，會(huì)由于彼此間距離及納米金尺寸的不同產(chǎn)生不同的熒光猝滅效應(yīng)[9]，基于納米金與熒光物質(zhì)的這一作用，納米金-熒光染料體系被廣泛應(yīng)用于基因、藥物等的分析檢測(cè)[10，11]。本文基于分散態(tài)納米金對(duì)羅丹明B的熒光猝滅作用強(qiáng)于聚集態(tài)納米金及阿米卡星對(duì)納米金的誘導(dǎo)聚集作用，通過向納米金-羅丹明B(AuNPs-RhB)體系中加入阿米卡星使納米金聚集體系熒光信號(hào)增強(qiáng)，建立了基于AuNPs-RhB體系熒光增強(qiáng)測(cè)定阿米卡星的熒光分析新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-2700型熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)，TU1901紫外-可見分光光度計(jì)(普析光學(xué)儀器有限公司)。

氯金酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，檸檬酸三鈉、羅丹明B(分析純，西安化學(xué)試劑廠)，阿米卡星(標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所，0904031105)，其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 AuNPs的制備

AuNPs按文獻(xiàn)方法制備[12]︰取50.00 mL 1.0 mmol/L的氯金酸于圓底燒瓶之中，加熱至回流后快速加入5.00 mL 38.8 mmol/L的檸檬酸鈉，繼續(xù)回流15 min后去掉加熱器，冷卻過濾后置于棕色瓶于冰箱中4℃存放備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

取1.00 mL RhB(1.0×10-5mol/L)和1.00 mL AuNPs置于比色管內(nèi)，將其搖勻，靜置作用15 min后稀釋定容至10 mL，得AuNPs-RhB測(cè)試液。取2.00 mL AuNPs-RhB測(cè)試液于10 mL比色管中，加入阿米卡星靜置反應(yīng)15 min后用超純水定容至5 mL，測(cè)定其熒光強(qiáng)度(對(duì)照組熒光信號(hào)值記為F0，樣品組熒光信號(hào)值記為F)，根據(jù)阿米卡星濃度與兩者熒光信號(hào)差值ΔF(ΔF=F-F0)的關(guān)系對(duì)阿米卡星含量進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 阿米卡星與AuNPs-RhB體系作用的光譜研究

a.AuNPs;b.AuNPs-RhB;c.AuNPs-阿米卡星;d.AuNPs-RhB-阿米卡星;e.RhB;f.RhB-阿米卡星;g.阿米卡星

圖1吸收光譜

檸檬酸鈉還原法制備的AuNPs帶負(fù)電荷，通過靜電排斥作用穩(wěn)定分散[12]，RhB通過靜電作用吸附在AuNPs表面，然后經(jīng)過分子碰撞與能量轉(zhuǎn)移使其熒光猝滅。當(dāng)AuNPs發(fā)生聚集時(shí)，由于尺寸變大使得其對(duì)RhB的熒光猝滅程度減弱[13]，阿米卡星可與AuNPs作用使其發(fā)生聚集，從而使其對(duì)RhB的熒光猝滅作用減弱，體系熒光信號(hào)增強(qiáng)。為了驗(yàn)證這一實(shí)驗(yàn)原理，實(shí)驗(yàn)分別對(duì)AuNPs、RhB、阿米卡星、AuNPs-RhB、AuNPs-阿米卡星、RhB-阿米卡星和AuNPs-RhB-阿米卡星進(jìn)行了光譜掃描，結(jié)果如圖1所示。比較圖中曲線a、b、c發(fā)現(xiàn)，向AuNPs中加入RhB后其吸收光譜在600 nm之后沒有出現(xiàn)新峰，表明RhB不會(huì)與AuNPs作用使其發(fā)生聚集，而曲線c在600-750 nm出現(xiàn)的新峰正是聚集態(tài)納米金的吸收峰，表明阿米卡星引起了AuNPs的聚集。曲線d(AuNPs-RhB-阿米卡星)中520 nm、570 nm及650 nm附近的吸收峰分別為單分散態(tài)納米金、羅丹明B和團(tuán)聚態(tài)納米金，比較曲線c、d、e、f可發(fā)現(xiàn)羅丹明B與阿米卡星和納米金都沒有發(fā)生相互作用或化學(xué)反應(yīng)，證明在AuNPs-RhB-阿米卡星體系中是阿米卡星與納米金發(fā)生作用使其發(fā)生聚集。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)RhB、AuNPs-RhB及AuNPs-RhB-阿米卡星進(jìn)行了熒光光譜掃描，結(jié)果如圖2所示。圖中曲線的峰形和最大發(fā)射波長一致，對(duì)比曲線a、c發(fā)現(xiàn)納米金對(duì)羅丹明B有很強(qiáng)的熒光猝滅作用，比較曲線b、c則可發(fā)現(xiàn)加入了阿米卡星之后，體系的熒光明顯有所恢復(fù)，這是因?yàn)榧尤肓税⒚卓ㄐ侵螅鹆薃uNPs的聚集，而聚集態(tài)的AuNPs對(duì)RhB的熒光猝滅作用不如單分散態(tài)AuNPs強(qiáng)。

a.RhB b.AuNPs-RhB-阿米卡星 c.AuNPs-RhB

圖2熒光光譜

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2.2.1 AuNPs與RhB的濃度和作用時(shí)間的選擇

固定羅丹明B(1.0×10-5mol/L)為1.00 mL，分別加入0.00、0.10、0.30、0.50、0.70、0.90、1.00、1.50和2.00 mL的AuNPs溶液，加超純水定容至10 mL測(cè)定其熒光(圖3)。結(jié)果顯示隨著AuNPs加入量的增加ΔF持續(xù)增大，加入1.00 mL AuNPs后ΔF增加趨緩，考慮到過量的納米金會(huì)影響測(cè)定靈敏度，所以實(shí)驗(yàn)選擇AuNPs與RhB的用量為體積比1∶1。

圖3 AuNPs用量對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響

將AuNPs與RhB按體積比1∶1混合后放置不同時(shí)間，考察二者作用時(shí)間對(duì)熒光測(cè)定的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)15 min后體系ΔF穩(wěn)定。故確定羅丹明B(1.0×10-5mol/L)與AuNPs按體積比1∶1混合放置15 min得到穩(wěn)定的AuNPs-RhB溶液。

2.2.2 AuNPs-RhB體系與阿米卡星作用時(shí)間的選擇

向AuNPs-RhB溶液中加入阿米卡星，反應(yīng)不同時(shí)間后進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示(圖4)加入阿米卡星的前10 min體系ΔF持續(xù)增加，之后趨于平穩(wěn)，這應(yīng)該是10 min后體系中兩種形態(tài)AuNPs達(dá)到平衡，為了保證體系的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)時(shí)間為15 min。

圖4 AuNPs-RhB體系與阿米卡星反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系熒光的影響

2.2.3 反應(yīng)溫度的選擇

將AuNPs-RhB溶液置于不同溫度下，分別加入阿米卡星作用15 min后測(cè)定其熒光，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高體系ΔF持續(xù)降低(圖5)，實(shí)驗(yàn)選擇在室溫(24℃)下進(jìn)行測(cè)定。

圖5 溫度對(duì)體系熒光的影響

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，采用本方法對(duì)阿米卡星進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，在7.80×10-6～1.25×10-4mol/L濃度范圍內(nèi)體系的ΔF值與阿米卡星濃度呈良好的線性關(guān)系(如圖6所示)，線性方程為ΔF=5.5×104c(mol/L)+60.1，相關(guān)系數(shù)r=0.997，檢出限(S/N=3)為2.2×10-6mol/L。對(duì)1.0×10-5mol/L的硫酸阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定11次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.7%。

a.7.80×10-6；b.3.00×10-5；c.5.00×10-5； d.7.00×10-5；e.1.00×10-4；f.1.25×10-4

圖6標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 干擾試驗(yàn)

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，考察了可能存在的常見干擾對(duì)阿米卡星測(cè)定的影響。當(dāng)阿米卡星的濃度為1.0×10-5mol/L時(shí)(相對(duì)誤差為±5%)，2000倍的生理鹽水，1000倍的葡萄糖，800倍的Zn2+、Al3+、Mg2+、Ca2+、D-果糖，不干擾測(cè)定。

2.5 樣品測(cè)定

取兩支不同廠家的硫酸阿米卡星注射液，用超純水稀釋后按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果表明，測(cè)定值與標(biāo)識(shí)值基本一致。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)的樣品回收率在97.2%～98.5%之間，表明該方法用于針劑中阿米卡星含量的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

表1 硫酸阿米卡星針劑中阿米卡星含量測(cè)定結(jié)果(n=5)

注：1.宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司(批準(zhǔn)文號(hào)H42021992)；2.成都通德藥業(yè)有限公司(批準(zhǔn)文號(hào)H51021294)。

3 結(jié)論

在AuNPs-RhB的混合體系中，AuNPs通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移使RhB的熒光猝滅，體系呈現(xiàn)弱熒光，阿米卡星的加入可使AuNPs產(chǎn)生聚集，由于聚集態(tài)AuNPs對(duì)RhB的熒光猝滅作用較弱，所以AuNPs-RhB體系的熒光有所增強(qiáng)，且增強(qiáng)程度在一定范圍內(nèi)與阿米卡星濃度成正比，據(jù)此確立了測(cè)定阿米卡星的熒光分析新方法。該方法對(duì)針劑中阿米卡星的測(cè)定結(jié)果令人滿意，也有望用于人體用藥后體液中阿米卡星的測(cè)定。