云南丹參主要有效成分含量的測定與比較

飛進強， 張圣潔， 徐紹忠， 趙昶靈

(云南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學與生物技術(shù)學院， 云南 昆明 650201)

云南丹參(Salviayunnanensis)為多年生的草本植物，是唇形科(Labiatae)鼠尾草屬(Salvia)的代表植物[1]。該藥首載于《滇南本草》，其味苦, 性微寒，色赤象火，入心經(jīng)。具有補心、生血、養(yǎng)心、定志、安神寧心、健忘怔忡、驚悸不寐、生新血、去瘀血、安生胎和落死胎等功效。一味可抵四物之功[2]，為云南習用的丹參藥材，廣泛分布于我國西南地區(qū)[3-4]。云南丹參的主要藥用部位為根部，其中的主要化學成分是脂溶性的二萜類和水溶性的酚酸類物質(zhì)，藥效與2015版《中國藥典》中的丹參(Salviamiltiorrhiza)類似，都具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩及涼血消癰等作用[5]，主要用于改善缺血再灌注損傷、心腦血管疾病的治療[6-8]。云南丹參作為云南地方性藥材，功效與丹參相同，作為地方藥材收載入1974版的《云南省藥品標準》[9]。云南丹參在云南地區(qū)具有悠久的使用歷史，分布廣，資源豐富，具有較高的開發(fā)利用價值。目前我國對云南丹參的研究主要集中在化學成分和藥理活性方面，對種質(zhì)資源的收集、栽培方式和化學含量之間的關(guān)系的研究尚處于空白。在用藥習慣上，將山東丹參稱為正品丹參，而云南丹參的利用未在藥用中進行使用，而對于云南丹參是否能成功代替山東丹參使用也存在爭議。錢子剛等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，云南丹參的總丹參酮類含量比山東丹參略高，總酚酸含量約高1倍，丹參酮ⅡA含量略高；原兒茶醛含量約為山東丹參的3倍。靳鵬博[10]的研究表明，輕度遮陰處理有利于提高丹參中丹酚酸B的含量。為云南丹參的合理栽培、云南丹參替代山東丹參及云南丹參種質(zhì)資源篩選、優(yōu)良品種選育和道地藥材品質(zhì)成因的研究提供理論依據(jù)，筆者采用高效液相色譜法對不同產(chǎn)地及不同栽培處理丹參的有效成分進行測定，并與山東丹參進行比較。

1材料與方法

1.1試驗材料

云南丹參：分別采集于云南個舊、蒙自、沾益和彌勒。山東丹參，采集于山東莒縣。采集不同地方的丹參均栽培于云南農(nóng)業(yè)大學后山實驗基地，以山東丹參為對照，設(shè)置2種栽培處理：露地栽培和40%遮陰栽培。樣品信息見表1。

表1 丹參樣品采集信息

試劑與儀器：甲醇(色譜純，由Dima公司生產(chǎn))，乙腈(色譜純，由美國fisher公司生產(chǎn))，超純水、Cary 60 UV-Vis 紫外可見分光光度計(安捷倫科技中國分公司)，Aglient1260高效液相色譜儀(安捷倫科技中國分公司)，B-220恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)，ZA100R3 電子精密天平(上海贊維衡器有限公司)。對照品：丹參酮Ⅰ(批號：568-73-0)，隱丹參酮(批號：35825-57-1)，丹參酮ⅡA(批號：568-72-9),丹酚酸B(批號：115939-25-8)，由成都克洛瑪生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2試驗方法

1.2.1供試品溶液的制備把不同種源的樣本丹參干燥至恒重，粉碎為細粉，過40目篩。稱取0.3 g細粉放置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL甲醇，密塞，精密稱定，30℃超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取濾液，即得丹參酮類供試品溶液。稱取0.15 g細粉放置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL的80%甲醇，密塞，精密稱定，30℃超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，移至10 mL量瓶中，加80%甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得丹酚酸B供試品溶液。

1.2.2標準品溶液的制備精密稱取標準品丹參酮Ⅰ、隱丹參酮及丹參酮ⅡA標準品，在加入甲醇制備為54 μg/mL、78 μg/mL及230 μg/mL的儲備液，濾過，即得丹參酮類物質(zhì)的標準品。精密稱取丹酚酸B標準品適量，加入80%甲醇稀釋定容，制備為245 μg/mL的儲備液，濾過，即得丹酚酸B的標準品。

1.2.3色譜條件丹參酮類物質(zhì)色譜條件：檢測波長270 nm，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)，流速為1.2 mL/min，柱溫25℃。以乙腈為流動相A，以0.02%磷酸為流動相B,梯度洗脫25 min，梯度洗脫0～6 min，A相61%，B相39%；6～20 min，A相61%～90%，B相39%～10%；20～20.5 min，A相90%～61%，B相10%～39%；20.5～25 min，A相61%，B相39%。進樣量10 μL。理論板數(shù)按丹參酮ⅡA不低于6 000。

丹酚酸B色譜條件：檢測波長286 nm，色譜柱為Agilent Exted-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速為1.2 mL/min，柱溫30℃。以乙腈為流動相A，以0.05%磷酸為流動相B，洗脫50 min，梯度洗脫0～15 min，A相17%～23%，B相83%～77%；15～30 min，A相23%～25%，B相77%～75%；30 min～40 min，A相25%～90%，B相75%～10%；40 min～50 min，A相90%，B相10%。進樣量10 μL。理論板數(shù)按丹酚酸B峰計算不低于6 000。

1.2.4高效液相色譜法考察線性考察:精密吸取各標準品溶液1 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL進樣，按確定的色譜條件進行分析，以標準品溶液的進樣量為橫坐標(x)，相對峰面積為縱坐標(y)構(gòu)建線性回歸方程。精密度試驗：精密吸取同一樣品的溶液，連續(xù)進樣6次，對各成分進行測定。重復性試驗：精密取同一丹參樣品，重復6次，制備樣品溶液，對各成分進行測定。穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一樣品溶液10 μL，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h和24 h后進樣，對各成分進行測定。加樣回收率試驗：精密稱量6份已知含量的樣品粉末，分別加入適量的丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、丹酚酸B的標準品，制備成供試溶液，分別測定丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、丹酚酸B的含量。加樣回收率的計算公式如下：

回收率=(實際測得的含量值-樣品中有效含量)/加入標準品的含量×100%

2結(jié)果與分析

2.1高效液相色譜法方法學考察結(jié)果

從表2可知，丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、丹酚酸B的線性回歸方程的R2分別為1、1、1和0.999 8，線性關(guān)系良好。精密度、重復性和穩(wěn)定性結(jié)果顯示各成分共有峰相對保留時間的RSD均<3%，各成分相對含量的RSD均<3%，表明該高效儀器的精密性良好，方法重現(xiàn)性較好，有效成分穩(wěn)定性較好。

丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA和丹酚酸B的加樣回收率分別為99.48%、99.92%、99.29%和99.78%。RSD分別為1.20%、0.42%、0.44%和1.26%，表明該測定方法準確度高。

表2 丹參活性成分標準品回歸方程

2.2丹參酮類含量

從表3可知，露地環(huán)境下，丹參酮Ⅰ含量，以云南沾益的丹參含量最高，為0.112 1%，云南沾益、個舊、蒙自、彌勒的丹參均顯著高于山東丹參。隱丹參酮含量，山東丹參的含量最高，顯著高于云南個舊、蒙自、沾益、彌勒丹參。丹參酮ⅡA含量，山東丹參的含量最高，顯著高于云南沾益、彌勒丹參，與云南個舊、蒙自丹參的含量差異不顯著。2015版《中國藥典》中規(guī)定，干燥品丹參中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的總含量不得低于0.25%，綜合看，露地生長環(huán)境中各樣品均未達到藥典的要求。

遮陰環(huán)境下，丹參酮Ⅰ含量，云南個舊、蒙自、彌勒的丹參含量均略高于山東丹參，云南沾益丹參酮Ⅰ含量最低，為0.056 8%；云南蒙自丹參酮Ⅰ含量最高，為0.128 8%，與云南沾益、彌勒和山東丹參之間差異顯著，與云南個舊的差異不顯著。隱丹參酮含量，云南個舊、沾益、蒙自丹參均高于山東丹參，其中，云南蒙自最高，為0.026 2%，云南彌勒丹參最低，為0.007 4%。云南蒙自的隱丹參酮的含量顯著高于云南沾益、彌勒，與云南個舊、山東丹參之間差異不顯著。丹參酮ⅡA含量，云南蒙自丹參最高，為0.272 9%，顯著高于云南沾益、彌勒，與云南個舊和山東丹參之間差異不顯著。2015版《中國藥典》中規(guī)定，干燥品丹參中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的總含量不得低于0.25%，綜合來看遮陰生長環(huán)境中，云南個舊、蒙自的云南丹參和來自山東的丹參符合2015版《中國藥典》的要求。在這5種供試樣品中，云南蒙自的丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA總含量最高，為0.427 9%。

2.3丹酚酸B含量

由表4可知，露地環(huán)境下，來自云南彌勒的丹酚酸B的含量最高，為4.199 4%，顯著高于來云南個舊和蒙自，與云南沾益、蒙自及山東丹參的含量差異不顯著。2015版《中國藥典》規(guī)定，干燥品丹參中丹酚酸B的含量不能低于3.0%，來自云南沾益、蒙自、彌勒的丹參和山東丹參符合該要求。

表3不同產(chǎn)地不同環(huán)境丹參的丹參酮類含量

Table 3 Tanshinone content ofS.yunnanensissamples from different producing areas under different growth environment %

產(chǎn)地Producing area丹參酮Ⅰ含量Tanshinone Icontent露地遮陰隱丹參酮含量Cryptotanshinonecontent露地遮陰丹參酮ⅡA含量Tanshinone IIA content露地遮陰3種丹參酮總量Total amount of three tanshinones露地遮陰云南個舊 Gejiu, Yunnan0.091 3 a0.109 4 ab0.007 9 cd0.020 1 ab0.115 2 ab0.235 5 ab0.214 4 a0.365 0 a云南沾益 Zhanyi, Yunnan0.112 1 a0.056 8 b0.011 3 c0.014 5 bc0.093 7 b0.041 2 c0.217 0 a0.112 5 c云南蒙自 Mengzi, Yunnan0.084 2 a0.128 8 a0.007 9 cd0.026 2 a0.124 2 a0.272 9 a0.216 4 a0.427 9 a云南彌勒 Mile, Yunnan0.096 9 a0.092 5 ab0.006 9 d0.007 4 c0.041 9 c0.143 0 bc0.145 7 b0.242 9 b山東莒縣 Juxian, Shandong0.031 0 b0.063 0 b0.050 3 a0.013 9 bc0.138 7 a0.241 1 ab0.220 1 a0.318 1 ab

注：表中同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note:Different lowercase letlers in the same column indicate significant difference atP<0.05.The same below.

表4不同產(chǎn)地不同環(huán)境丹參的丹酚酸B含量

Table 4 Salvianolic acid B content ofS.yunnanensissamples from different producing areas under different growth environment %

產(chǎn)地Producing area丹酚酸B含量 Salvianolic acid B content露地遮陰云南個舊 Gejiu, Yunnan1.926 6 c3.334 0 bc云南沾益 Zhanyi, Yunnan3.114 7 abc1.700 0 d云南蒙自 Mengzi, Yunnan3.055 0 abc5.836 2 a云南彌勒 Mile, Yunnan4.199 4 a2.137 6 cd山東莒縣 Juxian, Shandong3.790 2 ab4.652 9 ab

遮陰環(huán)境下，云南蒙自丹參的丹酚酸B含量最高，為3.005 0%，顯著高云南個舊、沾益、彌勒，與山東丹參差異不顯著。2015版《中國藥典》規(guī)定，干燥品丹參中丹酚酸B的含量不能低于3.0%，云南個舊、蒙自的丹參和山東丹參均符合要求。遮陰環(huán)境種植的山東丹參及云南個舊、蒙自丹參的丹酚酸B含量顯著高于露地環(huán)境的。在露地環(huán)境種植的云南沾益、彌勒的丹參丹酚酸B含量顯著高于遮蔭環(huán)境的。

3結(jié)論與討論

有效成分含量的高低是對藥用植物品質(zhì)評定的重要標準。2015版《中國藥典》規(guī)定，丹參類藥材脂溶性成分丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮的總含量不低于0.25%，水溶性成分丹酚酸B的含量不低于3%。在脂溶性成分含量方面，露地環(huán)境條件下云南丹參和山東丹參的含量均未符合2015版《中國藥典》的要求；遮陰環(huán)境條件下生長的來自云南個舊、蒙自的丹參和山東丹參都符合藥典的要求，其中云南蒙自丹參含量最高，較山東丹參增加34.52%。在水溶性成分含量方面，露地環(huán)境條件下，云南沾益、蒙自、彌勒的丹參和山東丹參都符合藥典要求，其中云南彌勒的丹參含量最高，較山東丹參增加10.8%；遮陰環(huán)境條件下生長的云南個舊、蒙自的丹參和山東丹參都符合藥典要求，其中云南蒙自丹參的含量最高，較山東丹參增加25.43%。

綜合看，在品質(zhì)方面，最好的是云南蒙自丹參，其脂溶性成分丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮的總含量和水溶性成分丹酚酸B的含量均符合《中國藥典》2015版的要求。這與文鳳娟[11]得出的產(chǎn)自云南蒙自的丹參是比較優(yōu)質(zhì)的研究結(jié)果一致 。

研究發(fā)現(xiàn)，遮陰環(huán)境條件較露地種植更有利于丹參有效成分含量的積累，王自力等[12]研究發(fā)現(xiàn)，進行果樹和藥用植物套種，不僅可以在夏季時降低地表溫度和減少土壤水分散失，而且藥用植物還能壓制雜草，改善果園小環(huán)境。鄒平洲等[13]研究發(fā)現(xiàn)，林下栽培和果樹套種可提高土地空間利用率、增加土地效益，這對現(xiàn)代農(nóng)林的發(fā)展具有重要意義。因此，可以考慮將云南丹參和山東丹參進行林下種植或與果樹等進行套作，增加有效成分積累的同時增加經(jīng)濟效益。

研究表明，來自云南蒙自的云南丹參品質(zhì)最好，在云南地區(qū)可以替代山東丹參種植與使用。在生產(chǎn)中可以將云南丹參進行合理的遮陰，以生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)、符合國家藥典規(guī)定的丹參藥材。