耐砷菌Pseudomonas 2-23T的分離鑒定及其對(duì)高砷沉積物中砷釋放的影響

周 行，祝賢彬，劉紫薇，曾憲春

(中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430074)

石門具有亞洲最大的雄黃礦，長期露天人工開采導(dǎo)致礦場周圍環(huán)境污染嚴(yán)重[1-3]。自然條件下，沉積物中砷的轉(zhuǎn)移受微生物[4-5]、有機(jī)碳源[6]、磷酸鹽和pH值[7]、硅酸鹽[8]等影響。微生物為維持其自身的生命活動(dòng)，進(jìn)化出了多種耐砷機(jī)制[9]。這些微生物分布廣泛，種類較多，如Bacillussp.C62、Pseudaminobacterarsenicussp.nov.CB3T、Luteimonasarsenicasp.nov.26-35T等[10-12]。自Migula首次提出假單胞菌(Pseudomonas)屬于γ-變形菌門[13]，此后對(duì)假單胞菌的研究不斷出現(xiàn)，包含對(duì)假單胞菌的普遍描述[14]、分類[15-19]等，使得人們對(duì)它有了更深入的了解。假單胞菌包含多個(gè)種，如P.fluvescenssp、P.stutzeri、P.balearica、Azotobacterchroococcum等[16-19]。這些菌株具有不同的生理生化特性，如從核桃樹潰瘍病中分離到的假單胞菌P.fluvescensspB62，能產(chǎn)生熒光色素和黃色的細(xì)胞色素，能水解氧化酶[16]；從支氣管吸入物分離得到的P.monteiliiCFML 90-60，能產(chǎn)生熒光色素、過氧化氫酶和細(xì)胞色素氧化酶，還能水解精氨酸[19]；從土壤中分離得到的Pseudomonassp.273，能利用1,10-二氯癸烷作為唯一的碳和能量來源，并且有脫氯作用[20]。

為了檢測(cè)高砷沉積物中假單胞菌的生理生化特性，本試驗(yàn)首先對(duì)湖南省石門縣雄黃礦區(qū)高砷土壤中[4,10]的菌株P(guān)seudomonas2-23T進(jìn)行分離與鑒定，然后通過分子生物學(xué)和微生物學(xué)手段對(duì)該菌株進(jìn)行分類和生理生化檢測(cè)，最后采用微生物學(xué)手段檢測(cè)其對(duì)含砷沉積物的作用。該研究不僅為假單胞菌家族增添了新成員，而且讓人們對(duì)假單胞菌不同的生活習(xí)性有了新的認(rèn)識(shí)。

1 試驗(yàn)方法

1.1 樣品采集

砷污染沉積物樣品采自湖南省常德市石門縣雄黃礦區(qū)(北緯29.7°，東經(jīng)111.0°)土壤，本次采集大約100.0 g砷污染沉積物樣品置于無菌的50.0 mL離心管中，快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并儲(chǔ)存在4℃冰箱中保存。

1.2 沉積物中砷含量的測(cè)定

(1) 沉積物樣品中總砷含量的測(cè)定：取沉積物樣品用王水消解，按文獻(xiàn)[21]描述的方法測(cè)定沉積物樣品中總砷含量。

(2) 沉積物樣品中可溶性砷含量的測(cè)定：直接稱取0.5 g均勻沉積物樣品，置于5 mL去離子水中，充分混勻后，放置2 h，中途搖動(dòng)2～3次，抽取1.0 mL混合液，在10 000 r/min下離心10 min,收集上清液，用于檢測(cè)沉積物樣品中可溶性砷的含量。

1.3 菌株P(guān)seudomonas 2-23T的分離與純化

稱取采集的沉積物樣品1.0 g，放入含5.0 mL高溫高壓滅菌(121℃,0.1 MPa,20 min)的MMM培養(yǎng)基中[22]，采用復(fù)合碳源(乳酸鈉、甲酸鈉、丙酮酸鈉)，添加1.0 mM的砷(As3+)，在30℃條件下避光靜置培養(yǎng)15 d，混勻培養(yǎng)液，取1.0 mL混合培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到9.0 mL相同的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)15 d，取100.0 μL培養(yǎng)液逐級(jí)稀釋為100、10-1、10-2、10-3濃度梯度的溶液，取各濃度梯度的溶液200.0 μL涂布在含1.0 mM As(III)和含10.0 mM復(fù)合碳源的MMM固體培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)48.0 h，挑取固體培養(yǎng)基上的單菌落于含砷的MMM液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d，再轉(zhuǎn)接到含砷培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，如此循環(huán)3次。分別取1.0 mL混合液用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取單菌落細(xì)菌DNA，采用Nanodrop 2000 (Thermo,USA)檢測(cè)DNA濃度。用16S r RNA引物27F[23](5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1541R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)擴(kuò)增16S r RNA，PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，65℃退火45 s，72℃延伸1 min (以上變性、退火、延伸共35個(gè)循環(huán))，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑選PCR產(chǎn)物條帶在1 500 bp左右的菌液送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 菌株P(guān)seudomonas 2-23T的鑒定

菌株P(guān)seudomonas2-23T的鑒定：菌株P(guān)seudomonas2-23T經(jīng)革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察(對(duì)照菌：革蘭氏陰性菌為大腸桿菌，革蘭氏陽性菌為StaphylococcusaureusAB 94004)。

菌株P(guān)seudomonas2-23T的生理生化特性檢測(cè)：將菌株接種到人工合成地下水固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待長出中等大小單一的菌落，挑取菌落按照梅里埃API 20 NE使用說明檢測(cè)其生理生化特性。

1.5 測(cè)定菌株P(guān)seudomonas 2-23T在不同碳源、溫度和砷濃度下的生長曲線

擴(kuò)大培養(yǎng)純化后的菌株P(guān)seudomonas2-23T，在4℃、5 000 r/min下離心15 min,收集菌體。為了檢測(cè)該菌株在不同碳源下的生長曲線，將菌體分別接種至含乳酸鈉、碳酸氫鈉、草酸鈉、乙酸鈉、甲酸鈉、丙酮酸鈉和檸檬酸鈉的無菌MMM培養(yǎng)基中，在30℃條件下振蕩培養(yǎng)，所有碳源濃度均為10.0 mM。

為了檢測(cè)該菌株在不同溫度下的生長曲線，將菌體分別接種至含10.0 mM乳酸鈉的無菌人工合成地下水中，分別置于0℃、4℃、30℃、37℃、50℃、75℃條件下培養(yǎng)。

為了檢測(cè)該菌株在不同砷濃度下的生長曲線，將菌體分別接種至含0.0 mM、1.0 mM、5.0 mM、10.0 mM、20.0 mM、40.0 mM亞砷酸鹽(As3+)的MMM培養(yǎng)基中，以10.0 mM的乳酸鈉為碳源，于30℃條件下振蕩培養(yǎng)。所有混合液均在試管中進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)變量設(shè)置3組試驗(yàn)。培養(yǎng)過程中，分別從0 h開始取樣，按設(shè)計(jì)的間隔時(shí)間分別取樣7次(不同碳源每次間隔9 h取樣，直至63 h；溫度和砷濃度每次間隔5 h取樣，直至35 h)，每次取樣大約1.0 mL，測(cè)定波長為600 nm時(shí)的菌懸液光密度值(OD600值)。

1.6 菌株P(guān)seudomonas 2-23T在有氧及厭氧條件下對(duì)含砷沉積物中砷釋放的影響

為了檢測(cè)菌株P(guān)seudomonas2-23T在有氧及厭氧條件下對(duì)高砷沉積物中砷釋放的影響，設(shè)置了如下試驗(yàn)：①滅菌沉積物+乳酸鈉(有氧，O2濃度約為21%)；②滅菌沉積物+乳酸鈉+菌株P(guān)seudomonas2-23T(有氧)；③滅菌沉積物+乳酸鈉(厭氧，O2<0.1%)；④滅菌沉積物+乳酸鈉+菌株P(guān)seudomonas2-23T(厭氧)。具體操作過程如下：分別稱取3.0 g均勻石門高砷沉積物樣品置于試管和25.0 mL血清瓶中，按文獻(xiàn)[21]準(zhǔn)備好MMM培養(yǎng)基，分別加入10.0 mL MMM培養(yǎng)基。其中，有氧試驗(yàn)組用帶橡膠塞的試管進(jìn)行試驗(yàn)，厭氧試驗(yàn)組則用帶橡膠塞和鋁蓋的血清瓶，并通入高純N2(>99.9%)以除去液體中和容器上部空間的氧氣后，密封。在所有試驗(yàn)體系中，沉積物濃度為3.0 g/10.0 mL。高溫高壓滅菌冷卻充分后，將血清瓶轉(zhuǎn)移到厭氧手套箱中，試驗(yàn)組加細(xì)菌2-23T；同時(shí)，在有氧試驗(yàn)組的試管中也加入細(xì)菌2-23T，在含有細(xì)菌的試驗(yàn)組中，細(xì)菌2-23T的初始濃度為2×107個(gè)/mL。所有試驗(yàn)都設(shè)置3組平行試驗(yàn)，并置于30℃條件下避光培養(yǎng)。從第0天開始，每24 h取樣1次，共取樣4次，測(cè)定溶液中可溶性砷的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 沉積物中砷含量的檢測(cè)

經(jīng)王水消解后，檢測(cè)到沉積物樣品中總砷的含量為96.7 mg/kg，可溶性砷的含量為29.3 mg/kg，說明采樣所在地沉積物砷污染異常嚴(yán)重(世界衛(wèi)生組織規(guī)定砷使用的安全標(biāo)準(zhǔn)濃度為10 μg/L[24])。微生物存在于這樣的環(huán)境中，能進(jìn)化出為適應(yīng)環(huán)境的獨(dú)特功能以維持其自身的生命活動(dòng)。

2.2 菌株P(guān)seudomonas 2-23T的分離與純化

在挑選的102個(gè)單菌落中，經(jīng)過3次轉(zhuǎn)接到含砷的培養(yǎng)液中培養(yǎng)后，取液體混合物提取細(xì)菌DNA，檢測(cè)到目標(biāo)菌株的DNA濃度為39.6 ng/μL。經(jīng)過DNA擴(kuò)增、測(cè)序，得到序列2-23T(基因文庫中基因編號(hào)為：MK774694)。利用BLAST軟件分析基因序列，顯示序列2-23T是假單胞菌屬的細(xì)菌。用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap設(shè)置為1 000，選取菌株Klebsiellasp.CRRI-81_WR13A[25]作為系統(tǒng)發(fā)育樹的外枝，見圖1。

圖1 菌株P(guān)seudomonas 2-23T 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析

經(jīng)過同源系列比較分析顯示，菌株P(guān)seudomonas2-23T屬于γ-變性菌門，與已知的γ-變性菌門中的圓褐固氮菌Avi 2[26]、C9[27]、 C5[27]、NCIMB 8003[28]等的同源性為97.45%～98.63%,與假單胞菌LV[29]、CC-G9A[30]、WM-3[31]、 MBR[32]、HL22-2[33]、NEAU-ST5-21[34]的同源性為95%～96%，表明菌株P(guān)seudomonas2-23T是假單胞菌進(jìn)化到圓褐固氮菌的中間體，它與系統(tǒng)發(fā)育樹的外枝菌Klebsiellasp.CRRI-81_WR13A[25]的同源性為87%。

2.3 菌株P(guān)seudomonas 2-23T的鑒定

菌株P(guān)seudomonas2-23T的形態(tài)特性顯示，其在MMM培養(yǎng)基上呈圓形、中間微隆起、黏稠光滑菌落；菌株P(guān)seudomonas2-23T的革蘭氏染色結(jié)果顯示，其為革蘭氏陰性菌。菌株P(guān)seudomonas2-23T的生理生化特性檢測(cè)結(jié)果，見表1。

表1 菌株P(guān)seudomonas 2-23T的生理生化特性檢測(cè)結(jié)果

注：“+”代表陽性反應(yīng)；“-”代表陰性反應(yīng)。

2.4 菌株P(guān)seudomonas 2-23T在不同碳源、溫度和砷濃度條件下的生長狀況

2.4.1 菌株P(guān)seudomonas2-23T在不同碳源下的生長狀況

本試驗(yàn)采用不同的碳源檢測(cè)菌株P(guān)seudomonas2-23T的生長狀況，發(fā)現(xiàn)在無機(jī)碳碳酸氫鈉(NaHCO3)、甲酸鈉、葡萄糖和蔗糖為碳源的試驗(yàn)組中未檢測(cè)到菌株的生長，而在乳酸鈉、草酸鈉、檸檬酸鈉、丙酮酸鈉和乙酸鈉為碳源的試驗(yàn)組中均檢測(cè)到菌株的生長，且菌株到達(dá)穩(wěn)定期的培養(yǎng)時(shí)間分別為45 h、45 h、45 h、45 h和36 h，其生長曲線見圖2。上述試驗(yàn)表明菌株P(guān)seudomonas2-23T是異養(yǎng)型菌株，且不能利用碳酸氫鈉、甲酸鈉、葡萄糖、蔗糖作為碳源。

圖2 不同碳源下菌株P(guān)seudomonas 2-23T的生長曲線

2.4.2 菌株P(guān)seudomonas2-23T在不同溫度下的生長狀態(tài)

不同溫度下菌株P(guān)seudomonas2-23T的生長曲線見圖3。

圖3 不同溫度下菌株P(guān)seudomonas 2-23T的生長曲線

由圖3可見，菌株P(guān)seudomonas2-23T在4～75℃范圍內(nèi)都能生長，但在溫度為30℃時(shí)最適于該菌株的生長，當(dāng)溫度高于或低于30℃時(shí)，菌株P(guān)seudomonas2-23T的生長均受到抑制。可見，菌株P(guān)seudomonas2-23T的最適生長溫度為30℃。

2.4.3 菌株P(guān)seudomonas2-23T在不同砷濃度下的生長狀況

不同砷濃度下菌株P(guān)seudomonas2-23T的生長曲線，見圖4。

圖4 不同砷濃度下菌株P(guān)seudomonas 2-23T的生長曲線

由圖4可見，利用乳酸鈉為碳源時(shí)，菌株P(guān)seudomonas2-23T在不同砷濃度(0.0 mM、1.0 mM、5.0 mM、10.0 mM、20.0 mM、40.0 mM)下，菌株的生長情況不同，該菌株的最適耐砷濃度為1.0 mM，當(dāng)砷濃度高于1.0 mM時(shí)，菌株P(guān)seudomonas2-23T的生長將受到抑制。

2.5 菌株P(guān)seudomonas 2-23T在有氧及厭氧條件下對(duì)高砷沉積物中砷釋放的影響

菌株P(guān)seudomonas2-23T在有氧及厭氧條件下對(duì)石門沉積物中砷釋放的影響，見圖5。

圖5 菌株P(guān)seudomonas 2-23T對(duì)石門高砷沉積物中砷釋放的影響

由圖5可見，菌株P(guān)seudomonas2-23T在利用乳酸鈉為碳源時(shí)，能夠促進(jìn)高砷沉積物中砷的釋放，在含滅菌沉積物和菌株P(guān)seudomonas2-23T的試驗(yàn)組中，有氧條件下溶液中的砷濃度在第1 d、第2 d和第3 d分別為0.66 mM，0.71 mM和0.78 mM，厭氧條件下溶液中的砷濃度在第1 d、第2 d和第3 d則分別為2.09 mM， 2.23 mM和2.44 mM；在有氧和厭氧條件下只含滅菌沉積物的對(duì)照組和試驗(yàn)組的第0 d，溶液中的砷含量為0.46±0.01 mM。由此可以看出，菌株P(guān)seudomonas2-23T具有促進(jìn)砷從沉積物中釋放到地下水的功能，且在厭氧條件下菌株P(guān)seudomonas2-23T促進(jìn)沉積物中砷釋放的能力強(qiáng)于有氧條件。

3 結(jié)論與展望

本研究采集了石門砷污染地區(qū)土壤沉積物樣品，經(jīng)分離與純化得到耐砷菌株P(guān)seudomonas2-23T經(jīng)革蘭氏染色鑒定其為革蘭氏陰性菌，通過分析其16S rRNA序列可知該菌株屬于假單胞菌；通過檢測(cè)該菌株在不同碳源、溫度和砷濃度下的生長狀況，可知其最適生長溫度為30℃,最適耐砷濃度為1.0 mM，能夠利用乳酸鈉、草酸鈉、檸檬酸鈉、丙酮酸鈉和乙酸鈉作為碳源，而不能利用碳酸氫鈉、甲酸鈉、葡萄糖和蔗糖作為碳源。微生物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株在厭氧條件下具有較強(qiáng)的促進(jìn)沉積物中的砷釋放到環(huán)境中的功能，表明該耐砷菌株大量存在于地下的缺氧環(huán)境中會(huì)加重地下水的砷污染。

菌株P(guān)seudomonas2-23T在處理含砷礦物方面具有良好的應(yīng)用前景，有望豐富活性土壤微生物種群的豐富度。該研究結(jié)果可為土壤環(huán)境修復(fù)提供一定的理論指導(dǎo)。