小劑量氯胺酮對抑郁大鼠海馬Rac1蛋白表達及樹突棘密度的影響*

朱賢林，王在平，葉 剛，姚娜娜，朱榮譽，牟俊英，吳幫林

(恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院麻醉科，湖北恩施 445000)

抑郁癥是一種常見的精神類疾病，具有高發(fā)病率和高致殘率等特點，嚴重危害人類身心健康[1]。傳統(tǒng)藥物如三環(huán)類抗抑郁藥和選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)極大地促進了抑郁癥治療，但這些藥物具有起效緩慢、緩解率低等缺點，尤其對重度抑郁患者治療效果不佳[2]。近年臨床研究發(fā)現(xiàn)，靜脈麻醉藥氯胺酮具有快速、持久的抗抑郁作用，尤其對于重度抑郁癥及SSRIs類藥物治療效果不佳的患者有效[3]，但其具體機制尚不清楚。研究表明，抑郁癥的發(fā)病與突觸可塑性改變有關(guān)，抑郁患者大腦邊緣腦區(qū)的容積明顯縮小，神經(jīng)元萎縮和樹突復雜性發(fā)生改變[4]。Rac1是小G 蛋白Rho家族中的一員，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元骨架重構(gòu)，能夠?qū)е峦挥|結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而調(diào)節(jié)突觸可塑性。本研究擬觀察小劑量氯胺酮對抑郁大鼠海馬Rac1蛋白表達及樹突形態(tài)學的影響，以期闡明氯胺酮發(fā)揮抗抑郁作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1動物及抑郁模型 成年雄性SD大鼠50只，鼠齡2～3個月，體質(zhì)量200～250 g，由湖北民族大學動物實驗中心提供。在室溫(22±2)℃條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由攝取食物和水，采用慢性不可預(yù)見性輕度應(yīng)激法(chronic unpredictable mild stress,CUMS)建立大鼠抑郁模型[5]，具體方法為：將大鼠孤籠飼養(yǎng)后，每天隨機安排一種應(yīng)激，連續(xù)28 d，且每3天應(yīng)激方法不重復。9種應(yīng)激方法為：夾尾1 min；禁食24 h；鼠籠45°傾斜24 h；禁水24 h；潮濕墊料24 h；晝夜顛倒24 h；45 ℃熱水游泳5 min；4 ℃冰水游泳5 min；水平搖晃鼠籠(1次/s)15 min。

1.2方法

1.2.1實驗分組及處理 抑郁建模完成后，根據(jù)糖水偏好實驗和曠場實驗結(jié)果，選取抑郁評分相近的48只大鼠，分為4組(n=12)：抑郁組(D組)、氯胺酮組(DK組)、氯胺酮+NSC23766組(DKN組)和NSC23766組(DN組)，另選同一批成年、SD雄性大鼠12只作為對照組(C組)。C組大鼠不接受CUMS應(yīng)激，腹腔注射生理鹽水8 mL/kg進行處理； D組大鼠只接受腹腔注射生理鹽水8 mL/kg處理；DK組大鼠腹腔注射氯胺酮(批號：KH091201，恒瑞醫(yī)藥)10 mg/kg；DKN組大鼠腹腔注射 Rac1抑制劑NSC23766(sc-204823A，美國Santa Cruz公司)2.5 mg/kg[6]，5 min后給予氯胺酮10 mg/kg腹腔注射；DN組大鼠給予NSC23766 2.5 mg/kg腹腔注射。以上處理每天1次，連續(xù)7 d。

1.2.2糖水偏好實驗 糖水偏好實驗是通過檢測糖水消耗量和糖水偏愛百分比作為衡量大鼠快感缺乏的客觀指標，從而評估大鼠的抑郁狀態(tài)。分別于建模后和氯胺酮處理后進行。大鼠給予2 d的糖水適應(yīng)，第1天每籠放入2瓶1%蔗糖溶液，第2天每籠放入純水和1%蔗糖溶液各1瓶。然后讓其禁飲、禁食23 h，隨后每籠放入提前準備好的1%蔗糖溶液和純水各1瓶，允許大鼠自由飲水1 h，然后收集水瓶稱重，計算每只大鼠1 h內(nèi)消耗的純水量和糖水量。糖水偏好百分比=[消耗的糖水量/(消耗的糖水量+消耗的純水量)]×100%[7]。

1.2.3曠場實驗 曠場實驗也常用于評估動物抑郁狀態(tài)[8]。實驗裝置為60 cm×60 cm×40 cm，四周底面全部涂黑的無蓋木制方箱，底面用白線劃分成12 cm×12 cm的25個方格。在箱子上方1 m處放置一攝像頭，鏡頭對準箱底，實驗在安靜環(huán)境下進行將動物小心放在箱底中心，觀察5 min內(nèi)水平移動距離(即水平穿行方格數(shù))和豎直站立次數(shù)。

1.2.4Western blot檢測海馬Rac1、Tiam1和α-chimaerin蛋白表達 取出冷凍的海馬組織稱重，在液氮中磨碎，加入RIPA緩沖液充分混勻(每克組織3 mL RIPA)，4 ℃離心10 min，轉(zhuǎn)速12 000 r/min，然后取上清液。加入緩沖液充分混勻后(緩沖液與上清液按4∶1的比例)，于100 ℃沸水中煮5 min。取50 μg蛋白樣品，先通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分離，然后電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，于室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗：Rac1(1∶1 000稀釋，23A8∶ab33186，英國Abcam公司)；Tiam1(1∶200稀釋，E-7∶sc-393315，美國Santa Cruz公司)；α-chimaerin(1∶500稀釋，G-8∶sc-365985，美國Santa Cruz公司)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，1∶1 000稀釋，美國Santa Cruz公司)，4 ℃搖床孵育12 h；含吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)漂洗10 min，共3次。然后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋，美國Santa Cruz公司)，室溫孵育2 h；PBST漂洗10 min，共3次。以GAPDH作為內(nèi)參，用增強化學發(fā)光法(ECL)檢測蛋白表達，并用凝膠成像系統(tǒng)照相。

表1 各組大鼠氯胺酮治療前后糖水偏好百分比和曠場測試結(jié)果

a：P<0.05，與C組比較，b：P<0.05，與D組比較；c：P<0.05，與DK組比較；d：P<0.05，與DKN組比較

1.2.5GST pull-down法檢測Rac1的活性 根據(jù)Rac1的活性分析試劑盒說明書(Active Rac1 Pull-Down and Detection Kit，美國Thermo Fisher Scientific公司)操作，具體如下：將冷凍的海馬組織稱重并在液氮中磨碎，然后于每毫升溶液中加入20 μL Rac1分析反應(yīng)物(PAK-1 PBD,瓊脂)，4 ℃下輕微搖晃60 min，充分混勻，14 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清液轉(zhuǎn)入到EP管中。加入4倍緩沖液，充分混勻。然后通過Western blot方法檢測GTP-Rac1蛋白量。

1.2.6高爾基染色及樹突形態(tài)分析 根據(jù)高爾基染色試劑盒說明書(FD Rapid GolgiStain Kit，PK 401/401A)進行操作，提前24 h配好A、B、C、D、E溶液(均由不同容積的PK 401和401A混合而成)。各組大鼠完成行為學實驗后隨即挑選6只用于高爾基染色，在腹腔注射2%戊巴比妥50 mg/kg麻醉后處死，迅速取出大腦，于去離子水中洗凈血液，然后浸入裝有A+B等量混合液的試管中，在室溫下避光保存14 d(次日換A+B等量混合液)。將大腦從A+B混合液中轉(zhuǎn)入裝有C液的試管中，室溫避光保存96 h(次日更換C溶液)。取出腦組織，在低溫下放入振動切片機中切片(-20 ℃～-22 ℃)，片厚150 μm，切片放入6%蔗糖溶液中[以0.1 mol/L杜氏磷酸緩沖液(DPBS)配制]，室溫避光保存72 h。將腦片放在漂染皿中，用去離子水漂洗2次，每次4 min。將去離子水吸凈，然后加入適量染色混合液(D液∶E液∶去離子水=1∶1∶2)孵育10 min。用負壓吸引器將染色混合液吸凈，加入去離子水清洗兩次，每次4 min。將腦片移至載玻片上，依次用50%、75%、95%的乙醇梯度脫水，每個乙醇濃度脫水4 min。然后再用100%乙醇脫水4次，每次4 min。二甲苯浸泡3次，每次4 min。滴加適量中性樹膠后用蓋玻片封片，晾干，避光保存。于光學顯微鏡(BX-51，日本Olympus公司)下觀察、拍照。選擇具有典型海馬CA1 結(jié)構(gòu)部位的神經(jīng)元，用NIH Image J軟件分析神經(jīng)元的樹突棘密度和樹突棘形態(tài)。在400倍顯微鏡下以神經(jīng)元胞體為圓心，做遞增間距為50 μm的同心圓，檢測樹突長度(μm)，同時根據(jù)重建圖像檢測樹突分支數(shù)。樹突棘密度指二級樹突分支上頂樹突部位每10微米的樹突棘數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠治療前后糖水偏好百分比和曠場實驗結(jié)果比較 氯胺酮處理前，各組大鼠的糖水偏好百分比、水平移動距離、直立次數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義(F=28.532、31.464、19.173，P<0.01)，與C組相比，D、DK、DKN、DN組糖水偏好百分比、水平移動距離和直立次數(shù)均明顯下降(P<0.01)，但D、DK、DKN、DN組之間進行比較時，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；氯胺酮處理后，與D組相比，DK組糖水偏好百分比、水平移動距離和直立次數(shù)明顯上升(P<0.05)，但仍然低于C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與DK組相比，DKN、DN組糖水偏好百分比、水平移動距離和直立次數(shù)均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠海馬Rac1蛋白表達及Rac1活性的比較 各組大鼠海馬Rac1蛋白表達水平及Rac1活性(Rac1-GTP)差異均有統(tǒng)計學意義(F=38.267,P<0.01)；與C組相比，D組Rac1蛋白表達水平及Rac1活性均明顯降低(P<0.05)；與D組相比，DK組Rac1蛋白表達水平及Rac1活性均明顯升高，但仍低于C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與DK組相比，DKN、DN兩組Rac1蛋白表達水平及Rac1活性均明顯降低(P<0.05),見圖1。

圖1各組大鼠海馬Rac1蛋白表達及其活性分析

2.3各組大鼠海馬Tiam1、α1-chimaerin蛋白表達的比較 各組大鼠海馬Tiam1、α1-chimaerin蛋白表達差異均有統(tǒng)計學意義(F=26.352、41.735,P<0.01)；與C組相比，D組Tiam1表達水平明顯降低，但α1-chimaerin表達水平明顯升高(P<0.05)；與D組相比，DK組Tiam1表達水平明顯升高，但α1-chimaerin表達水平卻明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與DK組相比，DKN、DN兩組Tiam1表達水平明顯降低，而α1-chimaerin明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.4各組大鼠海馬樹突棘長度及樹突棘密度的比較 對大鼠海馬CA1區(qū)樹突分析發(fā)現(xiàn)，各組大鼠海馬CA1區(qū)樹突棘長度、樹突分支節(jié)點數(shù)、樹突棘密度差異均有統(tǒng)計學意義(F=22.673、24.358、37.239,P<0.01)。與C組相比，D、DK、DKN、DN組樹突棘長度、樹突分支節(jié)點數(shù)、樹突棘密度均明顯減少或降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與D組相比，DK組樹突棘長度、樹突分支節(jié)點數(shù)、樹突棘密度均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與DK組相比，DKN、DN兩組樹突棘長度、樹突分支節(jié)點數(shù)、樹突棘密度均明顯降低(P<0.05)。見圖3、4。

圖2Westernblot檢測各組大鼠海馬Tiam1、α1-chimaerin蛋白表達

a：P<0.05，與C組比較，b：P<0.05，與D組比較；c：P<0.05，與DK組比較；A：高爾基染色圖片(×400)；B：大鼠海馬CA1區(qū)樹突棘長度；C：大鼠海馬CA1區(qū)樹突分支節(jié)點數(shù)

圖3高爾基染色分析各組大鼠海馬CA1區(qū)樹突棘形態(tài)學改變

a：P<0.05，與C組比較，b：P<0.05，與D組比較；c：P<0.05，與DK組比較；A：高爾基染色圖片(×1 000)；B：大鼠海馬CA1區(qū)樹突棘密度

圖4高爾基染色分析各組大鼠海馬CA1區(qū)樹突棘密度

3 討 論

CUMS是目前國際上構(gòu)建抑郁動物模型的常用方法。抑郁癥的核心癥狀主要表現(xiàn)為興趣缺失，而糖水偏好實驗和曠場行為學實驗?zāi)軌蚍从炒笫蟮奶剿饔团d趣缺失，因而可對大鼠的抑郁程度做出較準確的評估[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，與未接受建模干預(yù)的對照組相比，接受CUMS處理后的各組大鼠糖水偏好百分比、水平移動距離、直立次數(shù)均明顯下降，表明本研究中大鼠抑郁模型的構(gòu)建是成功的。

既往研究表明，氯胺酮作為一種非競爭性的NMDA受體拮抗劑，具有抗炎、抑制興奮性毒性及調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞凋亡等中樞保護作用[10-11]。近期臨床研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮對重度抑郁癥及SSRIs類藥物治療效果不佳的患者也具有快速的抗抑郁作用，重度抑郁癥患者單次靜脈注射低于麻醉劑量的氯胺酮(0.5 mg/kg)，40 min后就能產(chǎn)生快速、明顯、持續(xù)的抗抑郁效應(yīng)。注射24 h后，超過70%的患者癥狀改善了50%，其中有35%的患者注射1周后癥狀改善仍然明顯[12-13]。由于氯胺酮本身具有一定的精神不良反應(yīng)，且其精神不良反應(yīng)會隨著劑量的增加而更加明顯[14]。氯胺酮用于嚙齒類動物時，50 mg/kg的劑量被考慮為中等劑量或小劑量的上限，腹腔注射50 mg/kg的氯胺酮能夠誘導健康大鼠產(chǎn)生精神不良反應(yīng)，但10 mg/kg卻未發(fā)現(xiàn)大鼠行為學異常[15]。因此，本研究選擇10 mg/kg氯胺酮作為研究劑量，其目的在于更好地模擬臨床。本團隊前期研究也發(fā)現(xiàn)，小劑量氯胺酮能夠增強電休克(一種有效的物理學抗抑郁治療方法)的抗抑郁作用[16]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，與D組相比，DK組大鼠的糖水偏好百分比、水平移動距離、直立次數(shù)均明顯升高，表明大鼠的探索欲望明顯增強，興趣缺失得到有效改善，抑郁樣行為明顯減輕。本研究結(jié)果進一步證實了小劑量氯胺酮具有良好的抗抑郁作用。理論上小劑量氯胺酮應(yīng)該包括0～50 mg的不同劑量，然而本研究沒有觀察10 mg以外的其他劑量，也未探討不同劑量的氯胺酮對Rac1蛋白及大鼠抑郁樣行為的影響，這是本研究的一個局限。

神經(jīng)突觸會隨著神經(jīng)活動而出現(xiàn)增強或減弱的現(xiàn)象稱為突觸可塑性，樹突形態(tài)或樹突棘密度改變均直接影響著突觸的傳遞功能[17]。越來越多的研究表明，抑郁癥的發(fā)病與突觸可塑性的改變有關(guān)。腦影像學研究發(fā)現(xiàn)，抑郁患者大腦前額皮質(zhì)及海馬等邊緣腦區(qū)(與情感、情緒和認知功能有關(guān))的容積明顯縮小，并伴隨著大量神經(jīng)元的萎縮和突觸數(shù)量的減少[18]。尸檢分析進一步證實了這一發(fā)現(xiàn)，即重度抑郁患者背側(cè)前額皮質(zhì)(dlPFC)和海馬區(qū)椎體神經(jīng)元的體積變小，大量突觸丟失以及突觸蛋白發(fā)生了改變[4]。 經(jīng)典的SSRIs類藥物氟西汀在誘發(fā)突觸發(fā)生和增強突觸傳遞功能的同時，能夠發(fā)揮良好的抗抑郁效果[19]。本研究也發(fā)現(xiàn)，CUMS不僅能夠誘發(fā)大鼠抑郁樣行為，而且能夠?qū)е潞ｑRCA1區(qū)樹突棘密度降低和樹突復雜性下降，而氯胺酮治療能夠增加樹突棘密度和復雜性，并有效改善大鼠的抑郁樣行為。這些證據(jù)表明，突觸可塑性與抑郁癥發(fā)病相關(guān)，而氯胺酮可能通過調(diào)節(jié)突觸可塑性發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)。

研究證實，Rac1在突觸可塑性方面發(fā)揮著重要作用，激活或上調(diào)Rac1的表達可引起樹突棘的形態(tài)發(fā)生劇烈改變，包括樹突棘的延長和樹突棘密度的增加等[20]。GOLDEN等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在慢性社會挫敗應(yīng)激條件下，小鼠伏核區(qū)Rac1的表達及活性明顯下調(diào)，并誘導社會逃避、興趣缺失等抑郁樣行為，同時伴隨有樹突棘密度及形態(tài)發(fā)生改變，通過組成性激活突變基因過表達Rac1，則上述突觸結(jié)構(gòu)和形態(tài)學改變明顯被逆轉(zhuǎn)，而小鼠的抑郁樣癥狀得到有效緩解。

細胞內(nèi)的Rac1有兩種形式，即與GTP結(jié)合的激活形式GTP-Rac1和與GDP結(jié)合的失活形式GDP-Rac1。在GTP酶活化蛋白α1-chimaerin、Bcr/Abr的作用下，Rac1由激活形式轉(zhuǎn)變成失活形式。反之，在GDP/GTP轉(zhuǎn)換因子Tiam1、Kalirin7的作用下，Rac1由無活性的GDP狀態(tài)向有活性的GTP狀態(tài)轉(zhuǎn)變，從而引發(fā)下游一系列的級聯(lián)反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，CUMS能夠下調(diào)大鼠海馬Rac1蛋白的表達及活性，而氯胺酮改善大鼠抑郁行為的同時，能夠上調(diào)海馬Rac1的表達及活性，且預(yù)先給予Rac1特異拮抗劑NSC23766能夠有效逆轉(zhuǎn)氯胺酮對大鼠抑郁行為的影響及海馬區(qū)樹突棘形態(tài)的改變。另外，本研究也發(fā)現(xiàn)，氯胺酮能夠?qū)е耇iam1表達上調(diào)，而α1-chimaerin表達下降。這些證據(jù)表明，Rac1蛋白在氯胺酮抗抑郁效應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。

綜上所述，小劑量氯胺酮具有良好的抗抑郁效應(yīng)，其發(fā)揮抗抑郁作用的具體機制可能是通過上調(diào)海馬區(qū)Rac1蛋白表達及其活性，繼而增加海馬區(qū)樹突棘密度及改善突觸可塑性有關(guān)。