延安市寶塔區(qū)耳聾人群耳聾基因突變調(diào)查分析

杜偉平，楊 杰，鐘 瑛

(1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 延安 716000；2.延安市人民醫(yī)院，陜西 延安 716000)

我國(guó)殘疾人口數(shù)量龐大，據(jù)我國(guó)2006年第二次全國(guó)殘疾人抽樣調(diào)查結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)聽(tīng)力障礙人數(shù)高達(dá)2780萬(wàn)，居各類(lèi)殘疾之首[1]。耳聾成為威脅人類(lèi)健康以及致殘的最常見(jiàn)的疾病之一，給患者自身以及家庭帶來(lái)諸多不穩(wěn)定因素。臨床上根據(jù)是否合并其他系統(tǒng)的疾病將遺傳性耳聾又可分為綜合征型耳聾與非綜合征型耳聾，其中非綜合征型耳聾占比較大，達(dá)到60%～70%[2]。我國(guó)解放軍總醫(yī)院聾病分子診斷中心自2003年起在我國(guó)28個(gè)省市開(kāi)展了大規(guī)模的耳聾分子流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA及GJB3為導(dǎo)致我國(guó)遺傳性耳聾的主要四個(gè)致聾基因[3]。本研究通過(guò)對(duì)延安市寶塔區(qū)耳聾人群四個(gè)耳聾相關(guān)基因的九個(gè)突變位點(diǎn)：GJB2(35delG、176delG、235delC、299delAT)、SLC26A4(IVS7-2A>G、2168A>G)、12SrRNA(1494C>T、1555A>G)、GJB3(538C>T)進(jìn)行檢測(cè)，了解導(dǎo)致延安市耳聾人群致病的主要突變基因，為后續(xù)該地區(qū)開(kāi)展臨床治療及基因預(yù)防檢測(cè)提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年9月至2018年4月在延安大學(xué)附屬醫(yī)院耳科篩選的耳聾人群以及寶塔區(qū)聾啞學(xué)校的耳聾學(xué)生共297例，進(jìn)行相應(yīng)臨床檢測(cè)排除外傷等致病因素導(dǎo)致的耳聾及綜合征型耳聾，共篩選出NSHL耳聾人群146例，其中男性84例，女性62例；年齡8個(gè)月～37歲，平均年齡14±3.2歲。所有研究對(duì)象均于肘靜脈采集患者外周靜脈血2 mL，

EDTA-K2抗凝。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 TC-96型PCR擴(kuò)增儀由杭州博日提供，生物安全柜由濟(jì)南鑫貝西提供。晶芯BloMixerⅡ芯片雜交儀、slidewasher24芯片洗干儀、晶芯LuxScan-10K/B微陣列芯片掃描儀均來(lái)自于北京博奧生物集團(tuán)有限公司。

1.2.2 試劑 DNA提取試劑盒(康為世紀(jì)CW0544非柱式血液基因組提取試劑)，遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒(微陣列芯片法)來(lái)自北京博奧生物集團(tuán)有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 DNA提取 采用康為世紀(jì)CW0544非柱式血液基因組提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，提取步驟參照試劑盒提供的使用說(shuō)明進(jìn)行。

1.3.2 基因點(diǎn)陣排布 根據(jù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并經(jīng)解放軍總醫(yī)院全國(guó)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果確證的遺傳性耳聾突變熱點(diǎn)信息，設(shè)計(jì)了針對(duì)中國(guó)人群常見(jiàn)的四個(gè)基因相對(duì)應(yīng)的九個(gè)位點(diǎn)GJB2(35delG、176delG、235delC、299delAT)、SLC26A4(IVS7-2A>G、2168A>G)、12SrRNA(1494C>T、1555A>G)、GJB3(538C>T)檢測(cè)的微陣列探針排布圖，如表1所示。

表1 芯片各探針排位圖

注：QC、PC、BC和NC分別代表表面化學(xué)質(zhì)控、雜交陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照以及陰性對(duì)照

1.3.3 基因擴(kuò)增 DNA提取后采用杭州博日TC-96型PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，DNA擴(kuò)增完后用NanoQTM微型分光光度計(jì)進(jìn)行DNA含量檢測(cè)，檢測(cè)合格后進(jìn)行雜交檢測(cè)，具體循環(huán)過(guò)程如下表：

PCR擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：

37℃ 10min 1cycles

95℃ 15min 1cycles

60℃ 10min 1cycles

12℃ 1cycles

1.3.4 雜交、洗片 將PCR變性產(chǎn)物混合液加入芯片的點(diǎn)陣區(qū)域，封閉雜交盒，立即水平放入50℃預(yù)熱的雜交儀中雜交1 h，雜交完畢后按照洗干程序進(jìn)行洗片甩干。

1.3.5 掃描及結(jié)果判斷 用晶芯LuxScan-10K/B微陣列芯片掃描儀進(jìn)行芯片掃描，檢測(cè)GJB2、SLC26A4、12SrRNA、GJB3四基因九位點(diǎn)的突變情況，結(jié)果由微陣列芯片掃描儀系統(tǒng)自動(dòng)判讀。

2 結(jié)果

2.1 146非綜合征型耳聾患者基因芯片檢測(cè)結(jié)果

146例非綜合征型耳聾患者耳聾基因芯片檢測(cè)結(jié)果顯示：未突變者101例，突變者45例，檢出率為30.82%(45/146)。耳聾基因突變者中共檢出GJB2基因突變者25例，檢出率為17.12%。SLC26A4基因突變者17例，檢出率為11.64%。12SrRNA基因突變者3例，檢出率為2.06%。GJB3基因未檢出突變(見(jiàn)表2)。

表2 基因突變檢測(cè)結(jié)果

2.2 四個(gè)基因9個(gè)位點(diǎn)突變情況檢測(cè)結(jié)果

耳聾基因突變者中共檢出GJB2基因突變者25例，占總突變數(shù)的55.55%；包括235delG純合突變7例，235delC單雜合突變8例，299delAT純合突變3例，299delAT單雜合突變1例；其中含GJB2的雙雜合基因突變者6例，235delC復(fù)合176delG突變2例，235delC復(fù)合239delAT突變4例。SLC26A4基因突變者17例，包括2168A>G純合突變1例，2168A>G單雜合突變1例，IVS7-2A>G純合突變4例，IVS7-2A>G單雜合突變10例。3例耳聾患者檢測(cè)出攜帶有mtDNA12SrRNA基因突變，包括1494C>T純合突變1例，1555A>G純合突變2例，本實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)出攜帶有GJB3基因突變者，可能與受檢者數(shù)量較少有關(guān)(見(jiàn)表3)。

表3 基因突變位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

我國(guó)幅員遼闊，基因多態(tài)性又在不同的地域和民族有著不同的特點(diǎn)，我國(guó)殘疾人群數(shù)量龐大，尤其是聽(tīng)力缺陷人群。在耳聾人群中除遺傳性耳聾外，其他因素導(dǎo)致的耳聾大多難以控制，無(wú)法進(jìn)行早期干預(yù)，而遺傳性耳聾可通過(guò)檢測(cè)父母的突變基因及其相應(yīng)突變位點(diǎn)后采用PGS的方式進(jìn)行生育，減少耳聾患兒的出生。在中國(guó)NSHL人群中常染色體隱性遺傳占比75%～80%，常染色體顯性遺傳約10%～20%，性連鎖遺傳占1%～5%以及線粒體母系遺傳1%～2%[4]。本研究通過(guò)對(duì)延安市146例NSHL耳聾患者耳聾基因進(jìn)行檢測(cè)，以期獲取本地區(qū)耳聾人群耳聾基因基本突變譜，了解導(dǎo)致延安市耳聾人群致病的主要突變基因，為后續(xù)該地區(qū)開(kāi)展臨床治療及基因預(yù)防檢測(cè)提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示GJB2基因突變者25例，突變率為17.12%，是導(dǎo)致該地區(qū)NSHL人群致聾的主要突變基因，235delC位點(diǎn)突變占該基因突變的83%，為GJB2的主要突變位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)35delG基因突變。中國(guó)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果數(shù)據(jù)表明，中國(guó)耳聾人群中GJB2基因突變率為21.6%[5]，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近全國(guó)調(diào)查數(shù)據(jù)。該基因突變位點(diǎn)較多，在各地區(qū)的突變率也相差較大，研究發(fā)現(xiàn)歐美人群中Cx26基因突變多為30 delG或35 delG的熱點(diǎn)突變，在地中海國(guó)家和美國(guó)的NSHL患者中占60%～85%，在中國(guó)人群中尚未發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)[6]。研究中共發(fā)現(xiàn)6例GJB2的復(fù)合雜合基因突變，復(fù)合雜合突變是指?jìng)€(gè)體帶有突變類(lèi)型互不相同而位于同源染色體同一位點(diǎn)上的一對(duì)等位基因，該類(lèi)型相比單突變位點(diǎn)具有較高的患病率，應(yīng)高度重視。在我國(guó)GJB2基因突變常導(dǎo)致重度或極重度耳聾，約50%常染色隱性遺傳NSHL患者由GJB2基因突變所致[7]，這表明若有一方基因型為雜合基因，與具有相同基因型的攜帶者進(jìn)行婚配，后代患病的概率為25%，通過(guò)產(chǎn)前耳聾基因診斷指導(dǎo)生育，可顯著降低生育患兒的幾率。只由GJB2基因突變一種因素導(dǎo)致的耳聾，其聽(tīng)覺(jué)中樞和耳蝸神經(jīng)屬于正常，適合人工耳蝸植入，可顯著提高語(yǔ)言理解能力。

SLC26A4基因突變者17例，檢出率為11.64%，IVS7-2A>G為其主要突變位點(diǎn)。SLC26A4基因?qū)俪Ｈ旧w隱性遺傳，其突變常引起感音神經(jīng)性聽(tīng)力障礙，造成中度或極重度耳聾[8]。SLC26A4基因突變可導(dǎo)致Pendred綜合征與大前庭水管綜合征(EVAS)，前者表現(xiàn)為耳聾并伴有甲狀腺的腫大，后者僅表現(xiàn)為耳聾。我國(guó)EVAS患者的SLC26A4基因檢出率高達(dá)97%，常見(jiàn)突變位點(diǎn)為c.919A>G，占所有突變類(lèi)型的57.63%。因SLC26A4外顯子較多，因此明確主要突變位點(diǎn)可以提高耳聾基因的篩查效率。前庭導(dǎo)水管是聯(lián)系顱腔和內(nèi)耳的通道，因其異常擴(kuò)大，凡可引起顱內(nèi)壓變化的如頭部碰撞、感冒等因素均可導(dǎo)致EVAS患兒聽(tīng)力下降。因此早期診斷可以提醒家長(zhǎng)做好患兒監(jiān)護(hù)，防止由外界因素導(dǎo)致患兒病情的加重[9]。崔慶佳等[10]發(fā)現(xiàn)SLC26A4基因突變的耳聾患兒年齡段大多集中在1～3歲，出生時(shí)常擁有接近正常的聽(tīng)覺(jué)，早期的基因篩查以及正確的生活指導(dǎo)可大大降低外力因素致聾以及因聾致啞的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究有3例患者檢測(cè)出線粒體12SrRNA基因突變，突變率2.06%。線粒體基因?qū)儆谀赶颠z傳基因，可通過(guò)母親遺傳給下一代，而男性不會(huì)遺傳。氨基糖苷類(lèi)抗生素毒性耳聾的發(fā)生與其突變有著密切的關(guān)聯(lián)，部分患者對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物異常敏感，服用時(shí)藥物積累于耳蝸和前庭后，與12SrRNA結(jié)合最終導(dǎo)致細(xì)胞的損傷與凋亡，繼而影響聽(tīng)力[11]。因其具有母系遺傳的特點(diǎn)，不遵循孟德?tīng)柖?，?duì)家庭中女性成員的檢測(cè)至關(guān)重要，每一個(gè)攜帶者背后的廣大家族體系中的所有親代女性均攜帶該突變基因，可通過(guò)指導(dǎo)用藥，知識(shí)普及，遺傳咨詢，使其攜帶該基因但不一定致聾。

GJB3基因?qū)俪Ｈ旧w顯性或隱性遺傳性非綜合征型耳聾基因，被認(rèn)為與高頻聽(tīng)力下降有關(guān)，主要會(huì)引起遲發(fā)聽(tīng)力損失。我國(guó)本土克隆和鑒定的第1個(gè)耳聾致病基因GJB3基因在各地研究中的突變率并不高[12]，僅有1.85%[13]、0.94%[14]，本研究中未發(fā)現(xiàn)GJB3基因突變者，可能與樣本量或地區(qū)差異有關(guān)。

在該研究中，突變基因總檢出率為30.82%，仍有多半數(shù)耳聾人群未檢測(cè)出耳聾基因突變。由于該研究只檢測(cè)了遺傳性耳聾常見(jiàn)的的九個(gè)突變位點(diǎn)，具有一定的局限性，并未涵蓋與遺傳性耳聾相關(guān)的全部突變位點(diǎn)，當(dāng)檢測(cè)者結(jié)果為野生型時(shí)，并不能排除存在其他基因突變位點(diǎn)的可能，需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。耳聾病人因其自身情況特殊，給國(guó)家和社會(huì)造成了很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此利用基因遺傳模式對(duì)耳聾患者進(jìn)行婚育指導(dǎo)以及后代耳聾風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)估顯得格外重要。通過(guò)耳聾基因檢測(cè)相關(guān)知識(shí)的普及及推廣，進(jìn)行必要的基因篩查與干預(yù)，阻斷遺傳性耳聾在人群中的傳遞與發(fā)病。同時(shí)對(duì)于不同民族和地區(qū)人群應(yīng)采用符合各地區(qū)基因特點(diǎn)的檢測(cè)項(xiàng)目來(lái)提高檢測(cè)效率，提高其應(yīng)用價(jià)值。