牡蠣蛋白肽的制備及促進生長發(fā)育功能

王長偉 李八方 宋文山 劉楚怡 馮曉梅

摘要 [目的]研究牡蠣蛋白肽的制備工藝及其功能活性評價。[方法]以新鮮無殼牡蠣為原料，采用胰酶酶解的方法制備牡蠣活性肽，經(jīng)膜分離后使用HPLC測定其相對分子質(zhì)量分布，使用斷乳SD大鼠進行促進生長發(fā)育功能評價。[結(jié)果]得到均分子量為750 Da的活性肽，該活性肽在灌胃給藥劑量為2.0 g/kg（劑量/體重）時，具有改善大鼠生長發(fā)育的功能。[結(jié)論]該研究對牡蠣肽的生產(chǎn)具有一定指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞 牡蠣蛋白肽;制備工藝;生長發(fā)育;功能活性;SD斷乳大鼠

中圖分類號 TS254.5文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）17-0161-04

Abstract [Objective] The research aimed to study the preparation process of oyster protein peptide and its functional activity evaluation.[Method]The oyster active peptide was prepared by trypsin enzymatic hydrolysis using fresh oysters without shells as raw material.The oyster protein peptide were separated from the hydrolyzate by membrane， their molecular weight distribution was determined by HPLC， and the function of promoting growth and development was evaluated by SD weaning rats.[Result]The active peptide with average molecular weight of 750 Da was obtained， besides the protein peptide could improve the growth and development of rats at the dose of 2.0 g/kg （dose/body weight）.[Conclusion]The study has certain guiding significance to the production of oyster peptide.

Key words Oyster protein peptide;Preparation process; Growth and development; Functional activity; SD weaning rat

牡蠣味道鮮美、營養(yǎng)價值豐富，歷來受世人推崇。古人認為它是“水產(chǎn)品之最貴者”，古羅馬人把它譽為“海中美味——圣魚”，西方人稱之為“神賜魔石”“海中牛奶”，日本人則譽之為“根之源”[1]。牡蠣肉含有豐富的糖原、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、微量元素和維生素等，其中糖原占18%～39%，蛋白質(zhì)為45%～57%，脂肪為7%～11%。牡蠣氨基酸組成完善，據(jù)世界糧農(nóng)組織評定，牡蠣肉中必需氨基酸完全程度和質(zhì)量比例優(yōu)于人乳和牛乳[2]，其除了含人體必需的20種常見氨基酸外，還含有β-氨基丙酸、γ-氨基丁酸、鳥氨酸、?；撬岬榷喾N具有重要生理價值的氨基酸。特別是牛磺酸的含量尤其豐富，明顯高于其他動物性食品[3]，含量可以達到總氨基酸量的30.98%。

隨著食品、醫(yī)藥、生物技術(shù)的快速發(fā)展和營養(yǎng)知識的普及，以及人均收入水平的增加和消費水平的提高，人類對于食品的要求已經(jīng)從溫飽過渡到了營養(yǎng)水平，天然、健康、營養(yǎng)、安全已經(jīng)成為21世紀食品工業(yè)發(fā)展的主要議題。人類對牡蠣保健功能的認識已逾千年，早在我國古代《神農(nóng)本草經(jīng)》《名醫(yī)別錄》《本草綱目》《海藥本草》等醫(yī)療史籍中已經(jīng)有對于牡蠣藥用價值的記載。牡蠣又是中國衛(wèi)生部公布的第一批68種藥食同源的食品之一[4]。目前，運用現(xiàn)代科技手段，牡蠣資源在普通食品、保健食品、功能食品、醫(yī)藥、化學(xué)化工等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。近年來，不少學(xué)者報道了牡蠣提取物具有增強機體免疫力、抗疲勞、抗氧化、降血壓、降血糖等重要的生理功能，在我國醫(yī)學(xué)界得到廣泛的認可和應(yīng)用[5-10]，但對牡蠣肽的促生長發(fā)育作用仍鮮有報道。筆者采用新鮮去殼牡蠣為原料，使用胰酶酶解，分離后得到牡蠣功能活性肽，使用HPLC測定功能蛋白肽的相對分子質(zhì)量分布，并使用SD斷乳大鼠進行其促進生長發(fā)育功能評價。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及主要設(shè)備 新鮮去殼牡蠣，市售;胰酶，廣西龐博生物有限公司;SPF級SD斷乳大鼠，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司;其他試劑均為分析純。恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）;pH計（安萊立思儀器科技有限公司）;分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）;勻漿機（上海那艾精密儀器有限公司）;高速冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）;液相實驗室用膜分離設(shè)備（上海摩速科學(xué)器材有限公司）;高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 牡蠣肽制備的單因素試驗。

牡蠣肉洗凈瀝干水分，勻漿后加入一定比例的水，加胰蛋白酶進行酶解，酶解完成后，將酶解液加熱至90～100 ℃滅酶10～15 min，然后將其離心（10 000 r/min）10 min得上清液，測定水解度（DH），根據(jù)水解度大小確定最佳酶解條件。

DH=hhtot×100%=[水解液NH2的含量（μmol/mL）6.25 N（mg/mL）-原料蛋白質(zhì)中游離NH2含量（mmol/g）]/htot×100%

式中，DH為水解度（%）;h為水解后每克蛋白質(zhì)被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)（mmol/g）;htot為每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù)（mmol/g），牡蠣蛋白肽取 8.0。

1.2.2 牡蠣肽制備的響應(yīng)面試驗。根據(jù)單因素試驗結(jié)果使用響應(yīng)面設(shè)計軟件Design-Expert 8.0.6進行試驗設(shè)計，固定料液比1∶1、水解時間4 h，對不同溫度、不同pH及加酶量進行優(yōu)化，共設(shè)計17個反應(yīng)。酶解后將酶解液加熱至90～100 ℃滅酶10～15 min，然后將其離心（10 000 r/min）10 min得上清液，測定水解度（DH），根據(jù)水解度大小確定最佳酶解條件。

1.2.3 牡蠣蛋白肽的分離純化。通過離心分離、粗濾、超濾等步驟去除異味以及大分子蛋白，通過納濾去除部分鹽分并進行濃縮，冷凍干燥后分析其質(zhì)量并進行動物活性試驗。

1.2.4 分子量測定。

柱溫30 ℃，體積流量為0.8 mL/min下使用TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm（GEL LOT 502R）色譜柱，在檢測波長220 nm下測定，其中流動相為乙腈∶0.05%三氟乙酸，體積比為30∶70。

1.2.5 牡蠣肽功能活性的測定。

選用斷乳SD大鼠，4周齡，試驗開始時體重為50～80 g。試驗分組及受試樣品給予時間：分別設(shè)3個劑量組——低劑量組（0.5 g/kg）、中劑量組（1.0 g/kg）、高劑量組（2.0 g/kg），另外設(shè)一個正常對照組，實驗大鼠除每天給予基礎(chǔ)飼料和水外，每天灌胃受試樣品一次（正常對照組灌胃生理鹽水），受試樣品給予時間為42 d。給藥期間每周檢測大鼠2次體重，觀察記錄其體重變化情況。

試驗結(jié)束后，檢測試驗動物的體重、鼻肛長、鼻尾長、脛骨長度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 統(tǒng)計分析結(jié)果用平均數(shù)和標準差表示（Mean±SD）。SPSS 13.0 統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05組間差異顯著，P>0.05無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。給藥組身長高于正常對照組，且差異有顯著性，食物利用率不明顯低于正常對照組，可判定該受試樣品改善生長發(fā)育動物試驗結(jié)果陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣肽制備的單因素試驗

由單因素試驗結(jié)果（圖1～4）可知，隨著水解時間的延長，水解度越來越大，但在4 h時趨于平緩;不同的pH水解度大小不一樣，在酸性條件下，水解度很小，中性條件下，水解度加大，但也未達到最大，只有pH為8時水解度達最大，這與胰酶酶活的最適pH是一致的，堿性條件增大的情況下，水解度又隨之降低;相同條件下，隨著加酶量的增加，水解度也增加，但在3 000 U/g時又趨于平緩;水解溫度從30 ℃開始，隨著溫度的升高水解度增大，到50 ℃時水解度最大，超過50 ℃隨著溫度的增加，水解度又降低，這與胰酶酶活的最適溫度也是一致的;通過對不同固液比的酶解液水解度大小測定得知，固液比越高，水解度越大。

2.2 牡蠣肽制備的響應(yīng)面試驗

2.2.1 反應(yīng)溫度和pH對水解度的影響。把加酶量固定為0水平，可得到反應(yīng)溫度和pH的交互模型，如圖5所示。

由圖5可知，當(dāng)反應(yīng)溫度過高或過低時，水解度均比較低，只有當(dāng)反應(yīng)溫度取值適中時，在同一pH條件下，水解度達最大;同樣，pH過高或過低時，水解度均較低，只有取某一適中值時，在同一反應(yīng)溫度下，水解度最大。

2.2.2 反應(yīng)溫度和加酶量對水解度的影響。把pH固定為0水平， 可得到反應(yīng)溫度和加酶量的交互模型，如圖6所示。由圖6可知，當(dāng)固定反應(yīng)溫度為某一值時，隨著加酶量的增加，水解度逐漸增大，但到一定量時，增加緩慢;而固定某一加酶量時，水解溫度過高或過低，水解度均偏低，只有溫度取某一最適值時，水解度最大。

2.2.3 加酶量和pH對水解度的影響。

把反應(yīng)溫度固定為0水平，可得到加酶量和pH的交互模型，如圖7所示。

由圖7可知，固定某一pH，隨著加酶量的增加，水解度也在加大，但到一定量時，水解度增加緩慢;固定某一加酶量，pH過高或過低，水解度均較低，只有pH取某一合適值時，水解度最大。

通過響應(yīng)面試驗，得到胰酶酶解牡蠣液的最佳條件為溫度51.10 ℃、pH 8.23、加酶量3 750 U/g、水解時間4 h，該條件下水解度最大，為36.4%。這一結(jié)果與單因素試驗結(jié)果是相吻合的。

2.3 牡蠣蛋白肽的分離純化

牡蠣蛋白肽制備工藝路線為

酶解—滅酶—離心（10 000 r/min，10 min，2次）—濾膜過濾（0.45 μm）—超濾（截留分子量為10 K超濾膜）—納濾（脫鹽，截留分子量150～300 Da）—濃縮凍干。納濾時，當(dāng)溶液剩余原溶液的一半體積時，再補充一半體積繼續(xù)納濾，如此反復(fù)進行，使用電導(dǎo)率儀對納濾液及濾出液進行測定，當(dāng)最終納濾液電導(dǎo)率約為500 μs/cm時，停止納濾，將濃縮液進行凍干，最終測得脫鹽率在26%～35%。

2.4 分子量測定

對最佳酶解條件下得到的牡蠣肽進行分離純化，脫鹽后得到的產(chǎn)物進行分子量測定，結(jié)果如圖8所示，均分子量為750 Da。

2.5 牡蠣肽功能活性測定

2.5.1 SD大鼠日均采食量的變化。由表1可見，各劑量組SD大鼠的日均采食量與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），食物利用率無顯著性差異。

2.5.2 牡蠣蛋白肽對SD大鼠體重變化的影響。

由表2可知，低、中劑量組SD大鼠的初始體重、試驗終期體重與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;高劑量組SD大鼠的初始體重與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但試驗終期體重與對照組相比差異顯著（P<0.05）。

2.5.3 牡蠣蛋白肽對SD大鼠鼻肛長、鼻尾長、脛骨長度的影響。

由表3可知，低、中劑量組SD大鼠的鼻肛長、鼻尾長、脛骨長度與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;高劑量組SD大鼠的脛骨長度與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但鼻肛長、鼻尾長與對照組相比差異顯著（P<0.05）。

因此可以判定，42 d給藥結(jié)束后牡蠣肽高劑量組體重與對照組差異顯著（P<0.05），鼻肛長、鼻尾長大于對照組且差異顯著（P<0.05）。日均采食量與對照組比較差異不顯著（P>0.05）。由此判定該試驗制備的牡蠣蛋白肽在灌胃給藥劑量為2.0 g/kg時，具有改善大鼠生長發(fā)育的功能。

3 結(jié)論

使用胰酶水解新鮮無殼牡蠣制備所得的蛋白肽，經(jīng)離心、膜分離純化后得到了均分子量為750 Da的活性肽。經(jīng)SD斷乳大鼠喂養(yǎng)42 d后，灌胃給藥劑量為2.0 g/kg時，具有顯著改善大鼠生長發(fā)育的功能。該研究成果對于牡蠣肽的生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

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