PGPR菌劑對植煙土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

馮文龍　辜運富　余偉　閆芳芳　張映杰　張宗錦　羅富國　白加林　周歡

摘要 采用PCR-DGGE技術(shù)對煙草土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，對其中10條優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠回收、克隆測序及系統(tǒng)發(fā)育分析。DGGE圖譜結(jié)果顯示，施用多功能菌劑后細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性比未施用多功能菌劑高。在采用多功能菌劑的前提下，減少化肥的施用量不會對烤煙的農(nóng)藝性狀和理化性質(zhì)造成不良影響，T3處理（減肥10%）對土壤和烤煙的影響最明顯。典范對應(yīng)分析（canonical correspondence analysis，CCA）顯示，pH、全氮和有效磷是造成烤煙土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的主要因素。

關(guān)鍵詞 PGPR菌劑;植煙土壤;DGGE;群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號 S154.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）17-0146-05

Abstract PCRDGGE （polymerase chain reactiondenaturing gradient gel electrophoresis） technology was employed to analyze the composition of bacterial community in selective different soil samples.The recovery，cloning，sequencing and phylogenetic analysis of 10 dominant bands were performed.The results of the DGGE showed that there was a difference in the diversity of bacteria between the soil samples with and without PGPR.Under the premise of use of microbial inoculants，reducing the use of fertilizers would not adverse effects on the agronomic traits and physicochemical properties of fluecured tobacco.T3 treatment was most obvious impact on the soil and fluecured tobacco.The canonical correspondence analysis （CCA） showed? that soil pH，TN and AP were the critical factors to shape the bacterial community structure in tobaccogrowing soil.

Key words PGPR bactericide;Tobaccogrowing soil;DGGE;Community structure

我國煙葉長年規(guī)模種植，導(dǎo)致土壤質(zhì)量持續(xù)下降，嚴(yán)重制約了煙葉品質(zhì)的提高，尋求新型肥料來替代或者部分替代化肥的研究備受關(guān)注，最常見的替代傳統(tǒng)化肥的方法之一是施用微生物肥料和有機(jī)肥[1-2]。筆者以“促生抗病”為原則，根據(jù)2018年在攀枝花煙區(qū)開展的PGPR菌制田間篩選結(jié)果，應(yīng)用最佳菌劑組合，同時開展烤煙“減施增效”試驗，探索在煙區(qū)增施多功能微生物菌劑，以減少化學(xué)肥料施用，保證烤煙品質(zhì)，進(jìn)一步評價菌劑在改善烤煙土壤質(zhì)量、促進(jìn)烤煙生長、提升烤煙品質(zhì)方面的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

①酒糟有機(jī)肥：有機(jī)質(zhì)含量≥45%，氮+磷+鉀≥5%，pH 5.5～8.5;②烤煙復(fù)合肥：總養(yǎng)分含量≥55%，其中N、P2O5和K2O組成為10∶0∶44;硫酸鉀中K2O≥50%;③多功能菌劑：由3株細(xì)菌組成，即CN42（Streptomycete sp.）、P29（Streptomycete sp.）、P60（Streptomycete sp.），分別接種于高氏一號液體培養(yǎng)基，28 ℃下培養(yǎng)，菌液OD600達(dá)1.0后，按0.5%的比例接種于裝有500 g麥粒并經(jīng)滅菌處理的玻璃瓶中進(jìn)行擴(kuò)大繁殖，培養(yǎng)15 d，待菌種長滿整個麥粒瓶后取出，用清水稀釋成含活菌濃度約1×10 7/mL的溶液，將3種菌液按1∶1∶1的比例混合，進(jìn)行灌根處理。

1.2 試驗設(shè)計

在攀枝花米易煙區(qū)開展。土壤pH 6.25，有機(jī)質(zhì)12.96 g/kg，全氮1.47 g/kg，堿解氮124.63 mg/kg，速效鉀137.94 mg/kg，有效磷9.69 mg/kg。在田間采取隨機(jī)區(qū)組排列，5個處理，每個處理3個重復(fù)小區(qū)，共15個小區(qū)。

T1：有機(jī)肥（酒糟）+復(fù)合肥;

T2：有機(jī)肥（酒糟）+多功能菌劑（100PRA）+復(fù)合肥（100%）;

T3：有機(jī)肥（酒糟）+多功能菌劑（100PRA）+復(fù)合肥（90%）;

T4：有機(jī)肥（酒糟）+多功能菌劑（100PRA）+復(fù)合肥（80%）;

T5：有機(jī)肥（酒糟）+多功能菌劑（100PRA）+復(fù)合肥（70%）。

1.3 土樣采集與預(yù)處理

土樣采用“梅花樁”型原則，按照4分法將土樣進(jìn)行混勻，土樣混勻后取1 kg用無菌PET樹脂袋封裝，放于冰盒中帶回實驗室。將土樣于-20 ℃下保存?zhèn)溆?，取部分土樣進(jìn)行土壤理化的測定。

1.4 烤煙產(chǎn)量、產(chǎn)值測定

按照《中華人民共和國煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 142—1998煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查方法》和GB2635—92烤煙標(biāo)準(zhǔn)，測定烤煙收獲后經(jīng)濟(jì)和品質(zhì)性質(zhì)，測定指標(biāo)為產(chǎn)量、產(chǎn)值。

1.5 土壤理化性質(zhì)測定

按照魯如坤[3]土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析辦法進(jìn)行測定。采用CANOCO4.5.1軟件（Microcomputer Power，Ithaca，USA）分析土壤理化指標(biāo)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。

1.6 樣品總DNA的提取

稱取土壤樣品0.5 g，采用Fast DNA Spin Kit for Soil（Qbiogene，Carlsbad，CA，USA）的試劑盒方法，土壤微生物總DNA的提取按照試劑盒上的步驟進(jìn)行。

1.7 16S rRNA片段的PCR擴(kuò)增

第一輪PCR擴(kuò)增采用引物：BSF8（5′-AGAGTTTCCTGGCTCAG-3′）和BSR1514（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）[4]。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL （TIANGEN），2種引物各0.5 μL （10 μmol/L），0.5 μL模板DNA （10 ng/μL），加ddH2O補齊至50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 5 min， 94 ℃變性 1 min， 65～55 ℃退火 50 s， 72 ℃延伸90 s，共 20 個循環(huán)（每個循環(huán)溫度降低 0.5 ℃），然后在預(yù)變性和變性條件不變的情況下，在 55 ℃的退火溫度下擴(kuò)增15個循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸7 min，產(chǎn)物于4 ℃恒溫保存。用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物檢測，后用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化作為第二輪PCR的模板DNA。

第二輪PCR擴(kuò)增引物：968f-GC（5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3′）[5]和P1401：（5′-CGGTGTGTACAAGACCC-3′）[6]。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL （TIANGEN），2種引物各0.5 μL （10 μmol/L），1 μL模板DNA （10 ng/μL），加ddH2O補齊至50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 5 min， 94 ℃變性 1 min， 63～53 ℃退火 50 s， 72 ℃延伸90 s，共 20 個循環(huán)（每個循環(huán)溫度降低 0.5 ℃），然后在預(yù)變性和變性條件不變的情況下，在 53 ℃退火50 s擴(kuò)增15個循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸7 min，產(chǎn)物于4 ℃ 恒溫保存。用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物檢測，后用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳（DGGE） 采用變性劑梯度凝膠電泳（DGGE）的方法對25 μL純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性劑為35%～65%。配制好高低濃度膠后分別加入50 μL 10%（W/V）過硫酸銨和25 μL TEMED，使用Bio-Rad 475型灌膠系統(tǒng)進(jìn)行灌膠。待膠凝固后，每個點樣孔加入25 μL PCR產(chǎn)物，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)共15個泳道。在1×TAE緩沖液中，50 V 預(yù)跑30 min，然后180 V、60 ℃恒溫恒壓電泳7.0 h。電泳完畢后硝酸銀染色，然后拍照。

對土壤樣品 DGGE 圖譜借助于Bio-Rad公司的Quantity One 分析軟件對電泳條帶進(jìn)行多樣性分析。以多樣性指數(shù)（H）、豐富度指數(shù)（S）、優(yōu)勢度指數(shù)（C）和均勻度指數(shù)（EH）等指標(biāo)來評估富集培養(yǎng)中細(xì)菌的物種多樣性[7-9]。

H=-（niN）ln（niN），EH=HlnS，C=-（niN 2）

式中，ni為單一條帶的強(qiáng)度，N為所有條帶的總強(qiáng)度，S是泳道中條帶數(shù)目的總和[10]。

1.9 DGGE條帶克隆和測序分析

對DGGE圖譜條帶中的優(yōu)勢條帶和特異性條帶進(jìn)行切膠回收，用無菌去離子水反復(fù)沖洗3次，并用無菌槍頭將條帶擠碎，最后加入20 μL去離子水并置于4 ℃靜置備用。以該溶液為模板，用第二輪PCR擴(kuò)增不含GC夾子的P1401和P968-GC為引物，程序和體系與第二輪PCR相同，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用Clean-Up TM試劑盒（MO BIO Labs，Solana Beach，CA，USA）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后的PCR產(chǎn)物用pGEM-T Vector進(jìn)行克隆，挑選陽性克隆子，同時進(jìn)行菌液PCR檢測。測序由上海生物工程技術(shù)有限公司完成，將測序結(jié)果去除載體序列，通過在NCBI數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行BLAST比對，在GenBank獲取的相似度較高的序列，用MEGA 5.0軟件中的Kimura2Parameter Distance模型對獲得的同源序列和測定序列進(jìn)行序列匹配，然后采用 Neighborjoining（鏈接法）方法在Mega 5.0中進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物肥施用對煙葉產(chǎn)量和產(chǎn)值的影響

煙葉收獲、烘烤完畢后，按照國標(biāo)進(jìn)行分級計產(chǎn)，各處理煙葉產(chǎn)量、產(chǎn)值和均價見表1。由表1可知，從產(chǎn)量來看，各施肥處理下產(chǎn)量均顯著高于對照T1（T4>T2>T3>T5），與對照相比產(chǎn)量增加了5.93%～12.50%，其中T4和T2處理產(chǎn)量增高率>10%。相對于常規(guī)不減肥處理（T2），減肥處理下產(chǎn)量有增有減，T4處理下增長率大于T2，而其他2個處理均小于T2處理。從產(chǎn)值來看，各施肥處理下產(chǎn)值也均顯著高于對照T1（T2>T4>T3>T5），與對照相比產(chǎn)值增加了7.01%～14.80%。相對于常規(guī)不減肥處理（T2），減肥處理下產(chǎn)量略少，但差異不顯著。均以T3處理最高，T2處理次之，與對照T1處理均差異顯著，且其余處理均高于T1處理。

2.2 土壤理化性質(zhì)分析

由表2可知，5個土壤樣品均為中性或弱酸性，相對于不施加多功能菌劑的處理（pH=5.43），施加多功能菌劑的土壤pH為6.09～6.74，顯示施加多功能菌劑會使土壤pH增加，且隨著復(fù)合肥用量的增加而增加，在減肥10%（T3）處理時達(dá)到最高。5個土樣有機(jī)質(zhì)含量為32.46～40.34 g/kg。相對于僅施用有機(jī)肥和復(fù)合肥的常規(guī)施肥制度土壤而言，有機(jī)肥和復(fù)合肥與多功能菌劑配施，會增加土壤堿解氮含量，且就不同減肥處理而言，在減肥10%（T3）處理時，土壤堿解氮含量最高。速效鉀、有效磷、全氮都表現(xiàn)出此趨勢。

2.3 土壤內(nèi)細(xì)菌DGGE圖譜分析

不同施肥制度下植煙土壤中細(xì)菌16S rRNA基因群落的DGGE圖譜見圖1。其中不同位置的條帶代表不同的細(xì)菌種類，每個泳道中條帶數(shù)越多表明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，條帶強(qiáng)度越高表明該菌種屬的豐度越高[12]。從DGGE圖譜看，每個泳道均檢測到數(shù)目不等的條帶，電泳條帶數(shù)量、強(qiáng)弱和位置均存在一定程度的差異，各樣品中不僅存在共同的條帶，還具有各自獨有的優(yōu)勢條帶。施用多功能菌劑（PGPR）影響土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，且表明在施用多功能菌劑（PGPR）的基礎(chǔ)上配合施用不同量的復(fù)合肥細(xì)菌群落結(jié)果表現(xiàn)出差異。

通過比較不同施肥處理下的DGGE條帶，相對于不施用多功能菌劑僅施用有機(jī)肥和復(fù)合肥的常規(guī)土壤而言，施用多功能菌劑（PGPR）后出現(xiàn)一些獨有的優(yōu)勢條帶，表現(xiàn)出群落結(jié)構(gòu)的差異。此外，通過比較在施用多功能菌劑（PGPR）的基礎(chǔ)上，配以施用不同濃度復(fù)合肥的土壤后發(fā)現(xiàn)，土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)得更為復(fù)雜。其中以T3處理下群落結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜。

2.4 土壤內(nèi)細(xì)菌遺傳多樣性分析

根據(jù)DGGE圖譜對樣品中細(xì)菌群落豐富度（S）、多樣性指數(shù)（H）、優(yōu)勢度（C）和均勻度（EH）進(jìn)行計算，結(jié)果見表3。均勻度（EH）反映群落中不同物種多度分布的均勻程度，均勻度越接近1，表明其分布越均勻。多樣性指數(shù)（H）用于描述種群的個體出現(xiàn)紊亂和確定性，不確定性越高，多樣性越高。優(yōu)勢度指數(shù)（C）也可以在一定程度上反映樣品的多樣性。

施用PGPR菌劑后煙草土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出一定的多樣性，但土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性和豐富度變化不明顯。T3（減肥10%）下土壤細(xì)菌的豐富度、多樣性指數(shù)最高，無多功能菌劑處理（T1）下豐富度、多樣性指數(shù)最低。從5個處理的多樣性來看，施用多功能菌劑后土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性均高于未施加多功能菌劑的土壤（T1）。這說明多功能菌劑的施用對土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性具有一定影響。

2.5 基于DGGE圖譜回收序列

15個樣品DGGE電泳后，從圖譜中成功回收了10條條帶（圖1）。對切割條帶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化克隆后送上海生工生物工程有限公司測序。將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行Blast比對，找出同源性最高的序列。所有回收條帶的序列與數(shù)據(jù)庫中的模式菌株都具有一定的同源性，相似度在99%～100%。由表4可知，熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）和嗜熱假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）存在于5種不同施肥制度下的植煙土壤中。而有些是施加菌劑后新增的菌屬，如約氏不動桿菌種（Acinetobacterjohnsonii）存在于常規(guī)不減肥（T2）處理和減肥10%（T3）配施的土壤樣品中。沙福芽孢桿菌屬（Bacillus safensis）存在于全量施用化肥處理（T2）、減肥10%處理土壤樣品中。Methylobacteriumhispanicum僅存在于減肥30%（T5）處理的土壤樣品中。表明不同處理下的土壤樣品中存在特異性的細(xì)菌類群。

2.6 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析

在圖2可知，10條序列分別歸為蘇云金桿菌屬（Bacillus thuringiensis）、約氏不動桿菌種（Acinetobacter johnsonii）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、熒光假單孢菌（Pseudomonas fluorescens）、嗜熱假單孢菌（Pseudomonas fluorescens）、沙福芽孢桿菌屬（Bacillus safensis）、乙酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）、Kluyvera georgiana、Methylobacterium hispanicum。說明不同處理下烤煙土壤內(nèi)細(xì)菌存在一定的多樣性和豐富度。

2.7 土壤細(xì)菌種群和理化性質(zhì)典范對應(yīng)分析（CCA）相關(guān)分析

以種群重要值建立物種數(shù)據(jù)矩陣，以6個土壤理化性質(zhì)指標(biāo)建立環(huán)境數(shù)據(jù)矩陣，對不同處理下烤煙土壤細(xì)菌群落進(jìn)行CCA排序，排序結(jié)果見表5和圖3。CCA排序中第一和第二2個排序軸的特征值分別是0.291、0.242;細(xì)菌群落組成和土壤理化指標(biāo)與前2個排序軸的關(guān)系系數(shù)分別為0.952、0.850。相關(guān)系數(shù)高，排序效果理想，能夠反映不同處理下細(xì)菌群落分布特征。

在CCA排序圖（圖3）中，箭頭連線的長度表示理化因子與群落相關(guān)程度的大小，長度越長，代表其對群落的分布影響越大;環(huán)境因子與排序軸之間的正負(fù)相關(guān)性由箭頭所處的象限來表示;排序軸與箭頭連線的夾角代表這個理化因子與排序軸的相關(guān)性大小，夾角越小，相關(guān)性越大。從排序圖看，首先，6個理化因子的箭頭連線均較長，表明他們與種群的相關(guān)程度很高。從理化性質(zhì)箭頭連線與排序軸夾角看，CCA第一排序軸主要由pH和全氮構(gòu)成，且為負(fù)相關(guān)。而CCA第二排序列由有效磷、堿解氮、速效鉀、有機(jī)質(zhì)、全氮和pH構(gòu)成，前5項排序軸正相關(guān)，pH與排序軸負(fù)相關(guān)。其中有效磷的箭頭連線最長。表明pH、全氮和有效磷是影響群落分布的主要因子。

3 討論

3.1 不同施肥處理對煙草農(nóng)藝性狀和土壤理化的影響

PGPR肥料在小麥、水稻和玉米等農(nóng)作物及蔬菜上的應(yīng)用效果良好[13]。該試驗基于施用多功能菌劑的前提下，在煙草栽培中減少化肥的施用，會不同程度地影響烤煙煙葉化學(xué)品質(zhì)，穩(wěn)定烤煙的產(chǎn)量和產(chǎn)值，提高經(jīng)濟(jì)效益，與前人研究結(jié)果一致[14]。土壤有機(jī)質(zhì)礦化的速度及各種養(yǎng)分存在的狀態(tài)在一定程度上由土壤微生物種類、數(shù)量的變化及它們在土壤中的某些生物化學(xué)過程強(qiáng)度來反映。有效微生物群可加速土壤有機(jī)物轉(zhuǎn)化，提高土壤速效養(yǎng)分含量[15]。微生物肥料的施用使土壤主要肥力要素含量有所提高[16]。該試驗測定施用PGPR菌劑后烤煙土壤的pH、有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮、速效磷和速效鉀等理化指標(biāo)。發(fā)現(xiàn)施用菌劑后烤煙土壤的各項理化指標(biāo)均較CK處理下的烤煙土壤高，土壤性能得到改善。

3.2 不同施肥制度對植煙土壤群落結(jié)構(gòu)的影響

DGGE圖譜分析顯示，施用多功能菌劑（PGPR菌劑）與未施用多功能菌劑的植煙根際土壤細(xì)菌多樣性、群落結(jié)構(gòu)存在差異，說明多功能菌劑影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。此外，在伴施菌肥的前提下，減少一定化肥用量土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也存在差異。與該研究結(jié)果相似，Sang等[17]研究表明，在土壤中接種外源微生物對土壤微生物活性和微生物群落結(jié)構(gòu)造成直接或間接的影響，從而影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能發(fā)揮和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。但在減肥處理下，減肥對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和豐富度的影響不明顯。

3.3 土壤環(huán)境因子對植煙土壤群落結(jié)構(gòu)的影響

微生物群落結(jié)構(gòu)往往受到土壤微生物環(huán)境改變的影響。CCA將環(huán)境因子作為約束條件考慮到排序分析中，分析環(huán)境因子對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。研究認(rèn)為煙草土壤中細(xì)菌與土壤pH、速效氮和速效磷等顯著相關(guān)[18]。該研究CCA分析顯示，pH、全氮和有效磷的影響高于其他影響因子，是造成烤煙土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的主要因素。與該研究結(jié)果相似，王佩文等[19]研究發(fā)現(xiàn)土壤pH是細(xì)菌群落多樣性和豐度的關(guān)鍵影響因子。

該研究結(jié)果表明，由CN42（Streptomycete sp.）、P29（Streptomycete sp.）、P60（Streptomycete sp.）3株細(xì)菌組成的PGPR菌劑可以很大程度上提高煙葉品質(zhì)和產(chǎn)量，同時減少化肥的使用。施用多功能菌劑對微生物群落結(jié)構(gòu)造成影響，在減肥處理下，減肥對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和豐富度影響不明顯。pH、全氮和有效磷是造成烤煙土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的主要因素。這表明多功能菌劑PGPR在烤煙的減肥栽培上表現(xiàn)出明顯促進(jìn)效果，在烤煙栽培中的減施化肥方面具有潛在應(yīng)用價值。

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