Syndecan-1 在肺腺癌組織中的表達及臨床意義

王少強，魏松洋，寇衛(wèi)軍，李青元，鄭慶杰

肺癌是一種常見的原發(fā)性肺部惡性腫瘤，在世 界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均較高［1］。 其中非小細胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌總數(shù)的80%， 而腺癌是目前NSCLC 的主要組織學(xué)亞型［2］。 Syndecan-1 是跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的成員，參與細胞的增殖、黏附、遷移及信號傳導(dǎo)等生物學(xué)過程［3-7］。 關(guān)于Syndecan-1 在肺腺癌組織中的表達情況及臨床意義，目前國內(nèi)外的報道較少。 為此，該研究通過免疫組織化學(xué)法檢測肺腺癌組織中Syndecan-1 的表達情況，并分析其與患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，由此探討Syndecan-1蛋白表達與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料自2011 年6 月—2015 年6 月在筆者所在醫(yī)院行手術(shù)治療的原發(fā)性肺腺癌患者76例。男44 例，女32 例；平均年齡52.4 歲（31～78 歲）；所有患者術(shù)前均未接受放化療及免疫治療。 術(shù)后收集癌組織及癌旁正常肺組織（距腫瘤邊緣＞5 cm），4%中性甲醛固定，石蠟包埋，行Syndecan-1 蛋白表達免疫組化檢查，根據(jù)Syndecan-1 在肺腺癌組織中陽性表達程度，將患者分為兩個亞組：低表達組（n＝43）和高表達組（n＝33）。 根據(jù)臨床病理特征，收集患者的基本資料，包括性別、年齡、吸煙史、腫瘤分化程度（依據(jù)2004 版世界衛(wèi)生組織《肺部腫瘤病理組織學(xué)分類》確認組織學(xué)分型）、腫瘤直徑、胸膜浸潤、衛(wèi)星結(jié)節(jié)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM 分期（依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟2009 年修訂的肺癌分期標準）。 筆者所在課題組對患者進行為期3 年的隨訪觀察，以了解其生存相關(guān)信息。 該研究申請并獲得了醫(yī)院倫理委員會的批準，通過與患者及其家屬進行充分溝通并獲得其同意及簽字后開始研究。

1.2 方 法

1.2.1 主要試劑 鼠抗人syndecan-1（CD138）單克隆抗體購自Santa Cruz 公司。SP 免疫組化染色試劑盒、DAB 顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。 TRIZOL 反應(yīng)劑購自Invitrogen 公司。

1.2.2 實驗方法 該實驗采用SP 法進行免疫組織化學(xué)染色： 石蠟包埋組織按照4 μm 厚度進行連續(xù)切片，所得石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，于枸櫞酸鹽緩沖溶液中進行抗原修復(fù)。3%H2O2孵育15 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。 室溫下山羊血清孵育30 min， 消除非特異性抗體。 滴加小鼠抗人syndecan-1 單克隆抗體溶液，4 ℃過夜。 滴加生物素標記的IgG 抗體，室溫孵育2 h。 0.05%DAB 顯色劑顯色8～12 min。 蘇木素復(fù)染，氨水返藍，常規(guī)封片。以非特異性小鼠IgG 代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 結(jié)果判定 由筆者所在醫(yī)院進行獨立雙盲評分，以細胞膜和（或）細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色或棕褐色顆粒作為陽性結(jié)果。 根據(jù)染色強度和顯色細胞的比例采用半定量積分法進行綜合評分， 具體標準如下：（1） 每張切片隨機選取五個400 倍光學(xué)顯微鏡下視野，最終結(jié)果取平均值；（2）染色強度計分：按照未染色、淡黃色、棕色、棕褐色分別記為0、1、2、3分；（3）染色范圍計分：將染色陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比率按照＜5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%分別記為0、1、2、3、4 分；（4）將染色強度計分與染色范圍計分相乘得出染色結(jié)果：0 分為陰性，1～4 分為弱陽性，5～8 分為陽性，9～12 分為強陽性。根據(jù)肺腺癌組織中Syndecan-1 的表達情況分為兩組：0～4 分為低表達組，5～12 分為高表達組。

1.2.4 隨訪 隨訪開始時間為患者接受手術(shù)的時間，采用門診隨訪和電話隨訪的方式，平均2～3 個月隨訪一次，進行3 年定期隨訪。 對于死亡患者其死亡時間即為終止時間。 中途失訪4 例，其終止時間為最后一次隨訪時間，中途失訪患者亦納入生存分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。 運用χ2檢驗分析肺腺癌組織中Syndecan-1 的表達情況與各項臨床病理指標的關(guān)系； 運用Kaplan-Meier 法進行生存分析， 用logrank 檢驗進行曲線間比較；運用Cox 回歸進行單因素及多因素生存分析。取P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Syndecan-1 在肺腺癌及癌旁正常肺組織中的表達情況Syndecan-1 陽性染色主要位于細胞膜中，為棕色及棕黃色顆粒樣，但細胞質(zhì)中也有所表達。 在肺腺癌組織中Syndecan-1 的染色結(jié)果為：25例 （32.9%） 陰性，18 例 （23.7%） 弱陽性，19 例（25.0%）陽性，14 例（18.4%）強陽性；其中低表達者43 例（56.6%），高表達者33 例（43.4%）。 在癌旁正常 肺 組 織 中，Syndecan-1 染 色 結(jié) 果 為：29 例（38.2%）陽性，47 例（61.8%）強陽性；均為高表達。見圖1。

圖1 見封三。

圖1 不同肺腺癌組織中Syndecan-1 染色結(jié)果

2.2 Syndecan-1 的表達情況與肺腺癌患者臨床病理指標的關(guān)系肺腺癌組織中Syndecan-1 的低表達與腫瘤分化程度（χ2＝5.545，P＝0.032）、衛(wèi)星結(jié)節(jié)（χ2＝6.061，P＝0.018）、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2＝7.727，P＝0.01）、pTNM 分期（χ2＝14.434，P＜0.001）等因素存在顯著相關(guān)性，而與肺腺癌患者的性別（χ2＝0.268，P＝0.645）、年齡（χ2＝0.915，P＝0.364）、吸煙史（χ2＝0.120，P＝0.809）、腫瘤直徑（χ2＝2.605，P＝0.127）、胸膜浸潤（χ2＝1.735，P＝0.231）等因素無關(guān)。 見表1。

表1 Syndecan-1 的表達與肺腺癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

2.3 Syndecan-1 的表達情況與肺腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性運用Kaplan-Meier 生存曲線評估Syndecan-1 的表達情況與76 例肺腺癌患者的總生存率的相關(guān)性顯示：Syndecan-1 低表達組患者三年生存率為14.0%，平均生存時間為18.8 個月，中位生存時間為17 個月；Syndecan-1 高表達組患者三年生存率為30.3%， 平均生存時間為28.1 個月，中位生存時間為31 個月。 Syndecan-1 低表達組患者生存時間較Syndecan-1 高表達組患者明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝12.555，P＜0.001）。 見圖2。

圖2 見封三。

圖2 Syndecan-1 不同表達組Kaplan-Meier 生存分析

76 例肺腺癌患者臨床病理指標均納入單因素COX 回歸分析，結(jié)果顯示：腫瘤分化程度（P＜0.001）、腫瘤直徑（P＝0.007）、衛(wèi)星結(jié)節(jié)（P＝0.004）、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0.002）、pTNM 分期（P＜0.001）、Syndecan-1 表達（P＝0.001）與總生存率顯著相關(guān)。 將上述影響生存率的因素納入多因素回歸分析， 結(jié)果顯示：腫瘤分化程度（P＝0.004）、腫瘤直徑（P＝0.001）、pTNM分期（P＜0.001）、Syndecan-1 表達（P＝0.032），這些因素可以作為肺腺癌患者總生存率的獨立預(yù)后預(yù)測因子。 見表2。

表2 總體生存期單因素及多因素Cox 回歸分析

3 討 論

Syndecan-1 是跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的成員，表達于上皮細胞、漿細胞等多種類型細胞表面［3，4］。Syndecan-1 參與維持正常上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性［4］；并通過其共價連接的硫酸肝素側(cè)鏈結(jié)合一系列的細胞外配體， 如細胞因子、生長因子、細胞黏附分子、基質(zhì)成分等，調(diào)節(jié)細胞與細胞外基質(zhì)、細胞與細胞間的相互作用，影響細胞的增殖、黏附、遷移及信號傳導(dǎo)，調(diào)控血管生成，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程［5-7］。

大量研究發(fā)現(xiàn)，Syndecan-1 的表達與腫瘤惡性程度、腫瘤表型及侵襲潛力有關(guān)，它在不同腫瘤中表達模式各異［8］。Xu 等［9］對116 例膠質(zhì)瘤組織和15例正常腦組織進行研究后發(fā)現(xiàn)， 膠質(zhì)瘤組織中的Syndecan-1 基因和蛋白表達水平均高于正常腦組織，并且隨著膠質(zhì)瘤病理級別增高，其蛋白水平及信使RNA 水平也升高。Bologna-Molina 等［10］研究顯示， 在出現(xiàn)包膜外浸潤的甲狀腺乳頭狀癌中Syndecan-1 表現(xiàn)出高表達， 可能與腫瘤進展有關(guān)。Kim 等［11］研究表明，在原發(fā)性非肌層浸潤性膀胱癌中，Syndecan-1 高表達提示較低的腫瘤分期。 但Wei 等［12］通過研究發(fā)現(xiàn)，syndecan-1 表達缺失與結(jié)直腸癌發(fā)生、組織學(xué)分化和臨床分期密切相關(guān)。 該文研究結(jié)果顯示，Syndecan-1 陽性染色主要位于細胞膜中，為棕色及棕黃色顆粒樣，但細胞質(zhì)中也有所表達。 癌旁正常肺組織中Syndecan-1 均為高表達， 肺腺癌組織中Syndecan-1 高表達者33 例（43.4%），表達明顯降低。 筆者統(tǒng)計76 例肺腺癌患者相關(guān)臨床病理指標，并與Syndecan-1 的表達情況進行分析顯示：肺腺癌組織中Syndecan-1 的低表達與腫瘤分化程度（χ2＝5.545，P＝0.032）、衛(wèi)星結(jié)節(jié)（χ2＝6.061，P＝0.018）、 區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 （χ2＝7.727，P＝0.01）、pTNM 分期 （χ2＝14.434，P＜0.001） 存在相關(guān)性。結(jié)果表明Syndecan-1 低表達與肺腺癌較差的組織分化、較強的侵襲活性、較高的腫瘤分期有關(guān)，提示Syndecan-1 表達缺失或部分缺失促進了肺腺癌的發(fā)生及發(fā)展過程。

大量研究表明，部分腫瘤組織中Syndecan-1 的表達模式可與該腫瘤的惡性程度及患者的臨床預(yù)后直接相關(guān)，可以成為評估該腫瘤患者預(yù)后的生物學(xué)標志物［8］。 Nguyen 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在遠處轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中，Syndecan-1 的表達情況與組織學(xué)分級、激素受體狀態(tài)顯著相關(guān)，且Syndecan-1 高表達表現(xiàn)出較差的總生存率和無病生存率。 Anttonen等［14］研 究 證 實，Syndecan-1 高 表 達 在 肺 鱗 癌 中 與較好的預(yù)后及較高的總體生存率存在相關(guān)性。 Guo等［15］研究表明：在卵巢癌中，Syndecan-1 低表達患者臨床預(yù)后較差，可作為判斷腫瘤預(yù)后的指標。 筆者運用Kaplan-Meier 生存曲線來評估Syndecan-1的表達情況與76 例肺腺癌患者的總生存率的相關(guān)性顯示：Syndecan-1 低表達組患者三年生存率為14.0%，Syndecan-1 高表達組患者三年生存率為30.3%，Syndecan-1 低表達組患者生存時間較Syndecan-1 高表達組患者明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝12.555，P＜0.001）。 單因素COX 回歸分析結(jié)果顯示：Syndecan-1 低表達是影響肺腺癌患者總體生存率的危險因素之一 （P＝0.001）。 多因素COX 回歸分析結(jié)果顯示：Syndecan-1 低表達可與pTNM 分期一樣， 可以作為肺腺癌患者總生存率的獨立預(yù)后預(yù)測因子（P＝0.032）。據(jù)此推斷，Syndecan-1 表達還可以作為評估肺腺癌患者預(yù)后的生物學(xué)標志物。

綜上所述，該研究初步探討了原發(fā)性肺腺癌組織中Syndecan-1 的表達情況及其與肺腺癌患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。該研究表明，Syndecan-1低表達與肺腺癌的組織分化、侵襲活性、腫瘤分期以及患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。 故筆者認為，Syndecan-1 的表達可作為判斷肺腺癌患者預(yù)后的重要參考指標。