血清miR-155聯(lián)合HE4、CA199診斷子宮內(nèi)膜癌的價值

陳玉芬 韓敏 張秀俊 蘇海飛 張肖

[摘要] 目的 探討血清miR-155聯(lián)合人附睪蛋白4（HE4）、糖類抗原199（CA199）診斷子宮內(nèi)膜癌（EC）的價值。方法 選取2016年6月～2018年6月河北省邯鄲市第一醫(yī)院腫瘤科收治的68例EC患者為EC組，60例子宮內(nèi)膜增生患者為內(nèi)膜增生組，60名健康體檢健康者為對照組。檢測并比較三組血清miR-155、HE4、CA199水平，分析其對EC患者診斷價值。 結(jié)果 EC組、內(nèi)膜增生組患者血清miR-155、HE4、CA199水平均高于對照組（P < 0.05），且EC組高于內(nèi)膜增生組（P < 0.05）;EC病理分級G3、G2級患者血清miR-155、HE4、CA199水平均高于G1級患者（P < 0.05），G3級患者高于G2級患者（P < 0.05）;EC FIGO分期Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者血清miR-155、HE4、CA199水平均高于Ⅰ期患者（P < 0.05），Ⅲ期、Ⅳ期患者高于Ⅱ期患者（P < 0.05），Ⅳ期患者高于Ⅲ期患者（P < 0.05）;繪制ROC曲線顯示，三者聯(lián)合檢測的AUC、敏感性、特異性均高于單獨(dú)檢測。 結(jié)論 EC患者血清miR-155、HE4、CA199均高表達(dá)，且隨患者病理分級、FIGO分期升高而升高，三者聯(lián)合診斷敏感性、特異性高，對EC患者早期診斷具有較高臨床價值。

[關(guān)鍵詞] 子宮內(nèi)膜癌;miR-155;人附睪蛋白4;糖類抗原199;診斷價值

[中圖分類號] R737.33? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）07（b）-0100-04

Diagnostic values of serum MiR-155 combined with HE4 and CA199 in endometrial cancer

CHEN Yufen1? ?HAN Min1? ?ZHANG Xiujun1? ?SU Haifei2? ?ZHANG Xiao1

1.Department of Obstetrics and Gynecology， Handan First Hospital， Hebei Province， Handan? ?056002， China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology， the People′s Hospital of Guantao County， Hebei Province， Guantao? ?057750， China

[Abstract] Objective To investigate the diagnostic values of serum miR-155 combined with human epididymal protein 4 （HE4） and carbohydrate antigen 199 （CA199） in endometrial cancer （EC）. Methods Thirty-right patients with EC admitted to Oncology Department of Handan First Hospital in Hebei Province from June 2016 to June 2018 were selected as the EC group， 60 cases of endometrial hyperplasia patients were selected as the endometrial hyperplasia group， 60 healthy persons were taken as control group， the levels of serum microRNA-155， HE4 and CA199 were detected and compared among the three groups， and their diagnostic value for EC patients was analyzed. Results The levels of serum miR-155， HE4， and CA199 in EC group and endometrial hyperplasia group were higher than those in control group （P < 0.05）， and those in EC group were higher than those in endometrial hyperplasia group （P < 0.05）; the levels of serum miR-155， HE4， and CA199 in EC patients with pathological grades G3 and G2 were higher than those in patients with grade G1 （P < 0.05）， while those in patients with grade G3 were higher than those in patients with grade G2 （P < 0.05）; the levels of serum miR-155， HE4， and CA199 in EC patients with stage Ⅱ， Ⅲ， and Ⅳ of FIGO were higher than those in patients with stage Ⅲ （P < 0.05）， those in patients with stage Ⅲ and Ⅳ were higher than those in patients with stage Ⅱ （P < 0.05）， and those in patients with stage Ⅳ were higher than those in patients with stage Ⅲ （P < 0.05）. The ROC curve showed that the AUC， sensitivity and specificity of the combined detection were higher than those of the single detection. Conclusion Serum miR-155， HE4， and CA199 are highly expressed in EC patients， and with the increases of pathological grade and FIGO stage， the sensitivity and specificity of the combined diagnosis are high， which has high clinical value for early diagnosis of EC patients.

[Key words] Endometrial carcinoma; MiR-155; Human epididymis protein 4; Carbohydrate antigen 199; Diagnostic value

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占全球婦科惡性腫瘤第二位，并呈逐年升高趨勢，嚴(yán)重影響女性生命健康和生活質(zhì)量[1]。EC晚期患者5年生存期僅為30%～40%，隨著手術(shù)治療技術(shù)的不斷改進(jìn)，患者生存時間相對提高，但術(shù)后復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移仍較高。因此，尋找EC早期診斷指標(biāo)對提高患者生存率極其重要[2-3]。人附睪蛋白4（human epididymis gene product 4，HE4）在正常人血清中低表達(dá)，而在EC患者血清中高表達(dá)，糖類抗原199（carbohydrate antigen199，CA199）常作為消化道腫瘤鑒別診斷指標(biāo)，有研究報道，CA199在EC患者血清中表達(dá)水平高于健康女性，HE4和CA199可作為EC早期診斷檢測指標(biāo)[4-5]。微小RNA（microRNA，miRNA）參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，有研究報道m(xù)iR-155在EC患者組織和血清中均高表達(dá)，但關(guān)于血清miR-155、HE4、CA199聯(lián)合檢測對EC患者診斷價值的研究報道較少[6]。因此，本研究旨在探討血清miR-155聯(lián)合HE4、CA199對EC患者的診斷價值，報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年6月～2018年6月河北省邯鄲市第一醫(yī)院腫瘤科收治的68例EC患者為EC組，60例子宮內(nèi)膜增生患者為內(nèi)膜增生組，60例健康體檢健康者為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均經(jīng)組織病理學(xué)確診;②均為初次確診患者;③受試者對本研究知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入組前有放化療及免疫治療史;②入組前6個月內(nèi)有性激素使用史;③合并嚴(yán)重心、肝、腎等功能衰竭;④伴發(fā)嚴(yán)重感染及嚴(yán)重并發(fā)癥;⑤合并其他部位惡性腫瘤。EC組患者年齡42～65歲，平均（50.34±4.62）歲;病理分級：G1級17例，G2級42例，G3級9例;FIGO分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期28例，Ⅲ期18例，Ⅳ期7例。內(nèi)膜增生組年齡35～58歲，平均（48.85±4.73）歲;子宮內(nèi)膜不典型增生21例，子宮內(nèi)膜單純性增生39例。對照組年齡32～63歲，平均（49.58±6.12）歲。三組受試者年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 試劑與儀器

TRI Reagent BD RNA試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購自美國Gene Copoeia公司（生產(chǎn)批號：1611249、1608164、1512271）;HE4酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒購自英國Abcam公司（生產(chǎn)批號：0509283）;CA199試劑盒購自美國雅培公司（生產(chǎn)批號：69217）;全自動酶標(biāo)儀購自美國賽默飛世爾公司;全自動電化學(xué)發(fā)光分析儀購自德國羅氏公司;普通PCR儀德國Eppendorf公司;熒光定量PCR儀、紫外凝膠成像分析系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司;PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 檢測方法

①miR-155檢測：采用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測受試者血清miR-155水平，miR-155上游引物序列：5′-GCGAAAGCATTTGCCAAGAA-3′，下游引物序列：5′-CATCACAGACCTGTTATTGC-3′，內(nèi)參基因U6上游引物序列：5′-AGCGGGAAATCGTGCGTGACA-3′，下游引物序列：5′-GTGGACTTGGGAGAGGACTGG-3′，取待測血清提取總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，測定濃度和純度，符合要求方可進(jìn)行cDNA合成。冰盒上配制cDNA合成反應(yīng)體系，反應(yīng)體系：5×ReactionBuffer 4 μL、特異性引物1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、Ribolock RNase Inhibitor 1 μL、RevertAid M-MuLV RT 1 μL、總RNA 5 μL、無RNA酶水6 μL;反應(yīng)條件：25℃ 5 min、42℃ 40 min、75℃ 5 min，進(jìn)行cDNA合成，于-20℃保存?zhèn)溆谩RT-PCR檢測，以U6為內(nèi)參基因，合成cDNA為模板，配制反應(yīng)體系，反應(yīng)體系：Maxima SYBR Green qPCR 10 μL、上游引物1 μL、下游引物0.4 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 7.6 μL，設(shè)置3個重復(fù)，反應(yīng)條件：95℃ 30 s、95℃ 3 s、60℃ 30 s，40個循環(huán)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用2-△△Ct方法計(jì)算 miR-155相對表達(dá)量。②HE4檢測：采用ELISA檢測血清HE4水平，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待檢樣品孔及空白孔，操作步驟嚴(yán)格參照試劑盒說明書執(zhí)行，采用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸光度值，計(jì)算HE4濃度。③CA199檢測：電化學(xué)免疫發(fā)光法檢測血清CA199水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，所有檢測步驟由同一人操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征曲線（ROC曲線）預(yù)測血清miR-155、HE4、CA199對EC診斷價值。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清miR-155、HE4、CA199水平比較

EC組、內(nèi)膜增生組患者血清miR-155、HE4、CA199水平均高于對照組，且EC組高于內(nèi)膜增生組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 不同病理分級EC患者血清miR-155、HE4、CA199水平比較

EC病理分級G2、G3級患者血清miR-155、HE4、CA199水平均高于G1級患者，G3級患者高于G2級患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 不同F(xiàn)IGO分期EC患者血清miR-155、HE4、CA199水平比較

EC FIGO分期Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者血清miR-155、HE4、CA199水平均高于Ⅰ期患者（P < 0.05），Ⅲ期、Ⅳ期患者高于Ⅱ期患者（P < 0.05），Ⅳ期患者高于Ⅲ期患者（P < 0.05）。見表3。

2.4 血清miR-155、HE4與CA199聯(lián)合診斷EC價值

分別以EC患者血清miR-155、HE4與CA199表達(dá)水平繪制ROC曲線顯示，聯(lián)合檢測的AUC、敏感性、特異性及約登指數(shù)均高于單獨(dú)檢測。見表4、圖1。

3 討論

EC高發(fā)于50～60歲女性，特別是絕經(jīng)后女性，成為與卵巢癌、宮頸癌并列的女性生殖道三大惡性腫瘤之一[7-8]。EC的發(fā)病原因較多，可能與體質(zhì)、雌激素水平、遺傳等因素相關(guān)，其發(fā)病機(jī)制尚不明確[9]。腫瘤標(biāo)志物是一種化學(xué)物質(zhì)，往往在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)，但在腫瘤組織中常常高表達(dá)，常作為腫瘤的輔助診斷指標(biāo)，對腫瘤早期診斷及預(yù)后具有重要作用。

miR-155屬于miRNA，其表達(dá)水平升高可促進(jìn)細(xì)胞異常增殖、腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移。有研究報道m(xù)iR-155在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞72 h后可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，同時增強(qiáng)癌細(xì)胞浸潤能力[10-11]。Han等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-155在乳腺癌患者血清中高表達(dá)，具有較高診斷敏感性和特異性，可作為乳腺癌早期診斷潛在生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，miR-155在EC、子宮內(nèi)膜增生患者血清中均高表達(dá)，EC患者高于子宮內(nèi)膜增生患者，與上述研究結(jié)果基本相似，提示miR-155可能參與EC癌變過程。HE4最早在人附睪中克隆獲得，有研究發(fā)現(xiàn)HE4可作為EC單一腫瘤標(biāo)志物，并在EC不同腫瘤分期中有明顯表達(dá)差異[13]。CA199是一種糖類抗原，在女性生殖道腫瘤與消化道腫瘤中高表達(dá)，但靈敏性和特異性較差，常和其他腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測[14-15]。本研究結(jié)果顯示，HE4、CA199在EC、子宮內(nèi)膜增生患者血清中高表達(dá)，且EC患者高于子宮內(nèi)膜增生患者，與既往的研究[15-16]結(jié)果基本相似，提示血清HE4、CA199可用于EC的診斷。進(jìn)一步分析在EC病理分級和EC FIGO分期表達(dá)顯示，血清miR-155、HE4、CA199水平隨EC的病理分級和FIGO分期升高而增加，與Zhang等[17]和張智等[18]研究結(jié)果基本相似，提示血清miR-155、HE4、CA199表達(dá)水平與EC的病理分級和FIGO分期相關(guān)，可作為EC患者疾病嚴(yán)重程度的評估指標(biāo)。準(zhǔn)確評估EC患者疾病嚴(yán)重程度有利于選擇治療效果較佳的治療方案，而以往病情嚴(yán)重程度的評估主要以有創(chuàng)檢查為依據(jù)，給患者病情動態(tài)觀察及隨訪帶來諸多不便，因此，可選擇采用血清miR-155、HE4、CA199水平檢測評估EC病情嚴(yán)重程，且方法簡便、快捷[19]。最后，本研究通過ROC曲線分析顯示，三者聯(lián)合檢測的AUC、敏感性、特異性均高于單獨(dú)檢測，與劉曉良等[20]和Choi等[21]研究結(jié)果相似，提示血清miR-155、HE4、CA199聯(lián)合診斷EC的靈敏度和特異性高，可提高EC患者診斷效率。

綜上所述，本研究通過對EC患者血清miR-155、HE4、CA199水平檢測顯示，EC患者血清miR-155、HE4、CA199表達(dá)水平升高，并與患者病理分級、FIGO分期相關(guān)，三者聯(lián)合診斷敏感性、特異性高，對EC患者早期診斷及預(yù)后隨訪有較高的臨床價值。

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