泊洛沙姆407修飾吉非替尼脂質(zhì)體的制備及抗腫瘤活性研究

王洪濤，劉照容，王敬磊，王方，張彥卓

(徐州醫(yī)科大學，江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇 徐州 221004)

吉非替尼(gefitinib,GFB)是一種選擇性作用于表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的酪氨酸激酶抑制劑[1-2]，可以競爭性地結(jié)合EGFR胞內(nèi)ATP位點，阻斷信號傳導，抑制腫瘤細胞的繁殖、轉(zhuǎn)移，發(fā)揮靶向作用[3]。GFB臨床上作為抗晚期非小細胞肺癌治療的藥物，市售制劑為片劑，由于首過效應、P-糖蛋白外排作用，存在生物利用度低、個體差異大、胃腸道不良反應隨劑量增加而加重等問題[4-5]。

脂質(zhì)體是一類將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)形成的微型囊泡體，主要成分為磷脂、膽固醇，具有無毒、無免疫原性、生物相容性好的特點。難溶性藥物包埋于脂質(zhì)雙分子層中，有利于提高難溶藥物的溶解度[6-7]。脂質(zhì)體通過吸附、融合、內(nèi)吞等方式被細胞攝取，實現(xiàn)藥物的胞內(nèi)遞送[8-9]。但僅由磷脂、膽固醇形成的脂質(zhì)體穩(wěn)定性差、包封率較低，限制了體內(nèi)外運用。泊洛沙姆407是由聚氧乙烯和聚氧丙烯組成的嵌段聚合物，中間為疏水聚氧丙烯嵌段，兩側(cè)為親水性聚氧乙烯嵌段，具有良好的兩親性，可與生物膜材料良好相容[10]，同時對P-糖蛋白介導的藥物外排作用有抑制效果[11]。泊洛沙姆407與磷脂形成脂質(zhì)體時，可增加脂質(zhì)體的強度，同時作為表面活性劑可提高藥物的溶解度[12]。本課題制備泊洛沙姆407修飾的吉非替尼脂質(zhì)體(GFB-PML)，通過泊洛沙姆407的修飾增加藥物溶解性、包封率，發(fā)揮脂質(zhì)體的被動靶向與吉非替尼的分子靶向的雙重作用，通過細胞毒性實驗與小鼠體內(nèi)腫瘤生長實驗考察GFB-PML的腫瘤抑制效果，為吉非替尼的新劑型研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器 RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SH2-CA循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)；SB-5200超聲波清洗機(寧波新芝生物科技公司)；MS104S/01分析天平(梅特勒-托利多公司)；Nicomp 380/ZLS納米粒度及Zeta電位測定儀(美國PSS公司)；FD-1C-50冷凍干燥機(北京博醫(yī)實驗儀器公司)；CKX31顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；SHZ-82A數(shù)顯恒溫振蕩器(金壇區(qū)白塔新寶儀器廠)；H1850臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)。

1.1.2 試藥 大豆卵磷脂(上海阿拉丁試劑公司，批號：G1813018)；膽固醇(上海阿拉丁試劑公司，批號：G12600)；泊洛沙姆407(巴斯夫股份公司，批號：WPW1603B)；吉非替尼原料藥(南京亞東啟天藥業(yè)有限公司，批號：180420)；吉非替尼對照品(南京亞東啟天藥業(yè)有限公司，批號：180309)；透析袋(上海源葉生物科技公司，MCWO 8000-14000)；超濾管(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，MWCO 10K)；噻唑藍(MTT)細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號：20180413)；香豆素-6(北京百靈威科技有限公司，批號：LPC0R06);赫斯特熒光染料33342(上海阿拉丁試劑公司，批號：11318001)；羅丹明標記鬼筆環(huán)肽(翎盛科技有限公司，批號：T03598)；乙腈、乙酸銨為色譜純；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 細胞及動物 人肺癌細胞A549、小鼠肝癌細胞H22購于中國科學院上海細胞庫；昆明小鼠，雌性，體重(20±5)g，購于徐州醫(yī)科大學動物實驗中心，生產(chǎn)許可證號：SYXK(蘇)2010-0011，常規(guī)飼養(yǎng)1周后進行造模。

1.2 方法

1.2.1 GFB-PML的制備 采用薄膜分散-水化法制備GFB-PML。即稱取磷脂20 mg、膽固醇6 mg、泊洛沙姆407 10 mg、GFB 5 mg，置于100 mL茄形瓶中，加入30 mL無水乙醇超聲溶解。50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，待形成薄膜后，加入5 mL pH 7.4磷酸鹽緩沖液，超聲水化，得到脂質(zhì)體混懸液。將脂質(zhì)體混懸液過0.45 μm微孔濾膜，即得GFB-PML溶液?？瞻撞绰迳衬沸揎椫|(zhì)體(PML)處方中不含GFB，其他制備過程保持一致。將GFB-PML溶液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，-20 ℃預凍12 h后，于冷凍干燥機內(nèi)凍干24 h，得GFB-PML凍干粉。

1.2.2 GFB-PML內(nèi)藥物的測定

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent TC-C18柱(4.66 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-乙酸銨水溶液(51∶49，乙酸銨濃度為0.01 mol·L-1)，流速為1 mL·min-1，柱溫35 ℃，紫外檢測波長247 nm，進樣量20 μL。

1.2.2.2 GFB標準曲線的制備 精密稱取GFB對照品10.00 mg，溶于100 mL乙腈中，配成100 μg·mL-1的GFB儲備液。分別吸取上述溶液適量，乙腈稀釋至終濃度為0.05、0.1、0.5、1、5、10、50 μg·mL-1的溶液。高效液相色譜儀進樣，記錄峰面積。

1.2.2.3 精密度試驗 分別配制0.1、1、50 μg·mL-1的GFB溶液，于同一天內(nèi)重復測定5次，計算日內(nèi)相對標準偏差。重復測定3 d，計算日間相對標準偏差。

1.2.2.4 回收率試驗 取9份1 mL制備的PML溶液，加至25 mL容量瓶內(nèi)，分別加入適量“1.2.2.2”項下GFB儲備液，每組3份，乙腈定容至刻度線，制成低、中、高(0.2、2.0、10.0 μg·mL-1)濃度的供試品溶液。進液相測定峰面積，與同濃度GFB標準溶液測定峰面積進行比較，計算回收率。

1.2.3 GFB-PML的質(zhì)量研究

1.2.3.1 粒徑和Zeta電位的測定 吸取適量制備的GFB-PML溶液，用去離子水稀釋數(shù)倍并超聲分散，用Nicomp380/ZLS型納米粒度與Zeta電位測定儀測定粒徑、PDI值、Zeta電位，重復測定3次。

1.2.3.2 GFB-PML載藥量與包封率的測定 稱取10 mg GFB-PML凍干粉，記錄質(zhì)量m1。加5 mL乙腈超聲20 min破乳，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶并定容，過0.45 μm微孔濾膜后按“1.2.2.1”項下色譜條件進行液相檢測，記錄峰面積，對應濃度為C0。按以下公式計算載藥量：載藥量(%)=(25C0×10-3/m1)×100%。吸取500 μL GFB-PML溶液，加至超濾管中，9 500 rpm離心30 min，吸取濾過液，按“1.2.2.1”項下色譜條件進行液相檢測，記錄峰面積，對應游離濃度C1。同時吸取500 μL GFB-PML溶液加至25 mL容量瓶中，加乙腈定容，進樣并計算總濃度C2。按以下計算包封率：包封率(%)=(1-C1/50C2)×100%。

1.2.3.3 形態(tài)學觀察 將制備的GFB-PML混懸液用適量純化水稀釋，滴于銅網(wǎng)上，自然晾干，醋酸鈾負染后，進行透射電鏡拍攝，觀察形態(tài)。

1.2.3.4 體外釋放度實驗 稱取10 mg GFB-PML凍干粉，記錄質(zhì)量m2，5 mL釋放介質(zhì)(PBS7.4磷酸鹽緩沖液，含30%甲醇，V/V)溶解，轉(zhuǎn)移至透析袋中，置于含95 mL釋放介質(zhì)的燒杯內(nèi)，于37 ℃，100 rpm恒溫振蕩器內(nèi)振搖，平行3組。同時稱取GFB原料藥，甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)，相同釋放介質(zhì)進行釋放。平行3組。分別于第0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48 h從各燒杯內(nèi)取樣5 mL,同時補充相同體積的釋放介質(zhì)，樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過后，按“1.2.2.1”項下色譜條件進行濃度檢測，根據(jù)下式計算累積釋放率：累積釋放率(%)=(100×Cn+5×∑n-1Cn-1)×10-3/m2×100%，Cn為第n次取樣樣品濃度。以時間為橫坐標，GFB的累積釋放率為縱坐標，繪制釋放曲線。

1.2.4 細胞實驗

1.2.4.1 細胞培養(yǎng) 將A549細胞接種于含完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基)的培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待瓶內(nèi)細胞數(shù)量達80%～90%時可進行傳代。棄去細胞瓶內(nèi)培養(yǎng)基，生理鹽水清洗后加入1.5 mL胰酶，消化3 min后加入等體積完全培養(yǎng)基終止消化。將細胞轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，800 rpm離心3 min，棄去上清，加入完全培養(yǎng)基吹打均勻后吸取部分轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶內(nèi)，放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4.2 細胞攝取 按“1.2.1”項下GFB-PML制備方法，將GFB替換成香豆素-6溶液0.2 mL(0.5 mg·mL-1)制備載香豆素-6的熒光脂質(zhì)體(C6-PML)。取對數(shù)生長期的A549細胞，消化離心后，棄去上層液體，加入新DMEM培養(yǎng)基，計數(shù)，以每孔2×104個細胞接種于24孔板，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。吸去培養(yǎng)基后，按C6-PML終濃度為50、200、500、1 000 μg·mL-1將C6-PML培養(yǎng)基溶液加入孔內(nèi)，培養(yǎng)4 h；吸取500 μg·mL-1C6-PML培養(yǎng)基溶液加入孔內(nèi)，培養(yǎng)0.5、2、4 h，攝取結(jié)束后棄去培養(yǎng)基；生理鹽水清洗3次后，加入500 μL 4%多聚甲醛溶液固定10 min；生理鹽水清洗3次，再加入200 μL赫斯特染料，孵育10 min，繼續(xù)清洗3次。于倒置熒光顯微鏡觀察攝取情況并拍照。

1.2.4.3 細胞毒性評價 取對數(shù)生長期A549細胞置于96孔板內(nèi)，密度為每孔1×104個。24 h后棄掉原有培養(yǎng)基，更換為無血清DMEM培養(yǎng)基。按照培養(yǎng)基內(nèi)PML終濃度為20、50、100、200、300、400、500、1 000 μg·mL-1加入配置好的PML溶液，每個濃度6個復孔，每孔100 μL。加樣后培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h；24 h后每孔加入50 μL MTT溶液(2 mg·mL-1)，繼續(xù)放回培養(yǎng)箱孵育4 h；4 h后吸出上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置于平板搖床100 rpm搖動10 min，酶標儀492 nm波長處檢測吸光度值(OD值)。按以下公式計算：細胞存活率(%)=(OD實驗-OD陰性對照)/(OD陽性對照-OD陰性對照)×100%，陽性對照組為不加藥物的含細胞組，陰性對照組為僅加二甲基亞砜的無細胞組。同時，按照培養(yǎng)基內(nèi)GFB終濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、20 μg·mL-1加入GFB原料藥和GFB-PML，培養(yǎng)24 h后檢測吸光度值并計算細胞存活率。

1.2.5 體內(nèi)抗腫瘤研究 取2只雌性昆明小鼠腹腔接種小鼠肝癌細胞(H22細胞)懸液，約7 d形成腹水模型。抽取腹水，于離心管內(nèi)加等量生理鹽水，1 000 rpm離心3 min，棄上清后，生理鹽水分散并計數(shù)。細胞濃度調(diào)整到每毫升2×107個細胞后，于小鼠腹部右下側(cè)皮下接種0.2 mL細胞懸液，待瘤體生長到約800 mm3時開始給藥。32只雌性荷瘤小鼠隨機分為4組，每組8只，分為生理鹽水組，PML組，GFB組，GFB-PML組，尾靜脈給藥，GFB劑量為6 mg·kg-1，每兩天給藥1次共給藥4次，給藥后1 d游標卡尺測量瘤徑(長徑D，短徑d，mm)。按以下公式計算瘤體積V(mm3)=0.5×D×d2，繪制腫瘤體積曲線。給藥結(jié)束后解剖瘤塊，稱重，并按公式計算抑瘤率：抑瘤率=(生理鹽水組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/生理鹽水組平均瘤重×100%。

2 結(jié)果

2.1 GFB-PML的質(zhì)量研究

2.1.1 GFB標準曲線、精密度、回收率結(jié)果 GFB的線性回歸方程為A=72.575C+3.961 5，r=1，表明在0.05～50 μg·mL-1范圍內(nèi)峰面積與濃度線性良好。低、中、高3個濃度下，測得日內(nèi)精密度RSD分別為0.45%、0.27%、0.19%(n=5)；日間精密度RSD分別為0.81%、0.84%、1.08%(n=3)，均小于3%，表明該液相方法適合本品測定。低、中、高濃度GFB回收率為101.49%、98.12%、100.88%(n=3)，RSD均小于3%，表明回收率符合要求。

GFB-PML粒徑分布結(jié)果及電位測定如下：平均粒徑為(190.00 ± 8.77)nm，PDI值為0.31±0.04，Zeta電位為(-15.07±6.11)mV。載藥量測定結(jié)果為5.09%±0.48%，包封率測定結(jié)果為99.53%±0.34%。

制備的GFB-PML透射電鏡結(jié)果如圖1。透射電鏡觀察可見GFB-PML呈球狀或類球狀，粒徑集中在50～100 nm。

圖1 GFB-PML的透射電鏡圖

2.2 體外模擬釋放結(jié)果 以釋放時間為橫坐標，GFB累積釋放百分率為縱坐標，繪制釋放曲線，結(jié)果見圖2。其中A代表GFB原料藥組累積釋放率，B代表GFB-PML組中GFB累積釋放率。GFB原料藥組2 h時GFB累計釋放率為59.83%，8 h累積釋放率接近100%，釋放迅速。GFB-PML組2 h時GFB累計釋放率為21.62%，釋放相對于原料藥組較為緩慢，這是由于GFB-PML有較高的包封率，藥物GFB無法迅速透過雙分子層進入釋放介質(zhì)中；GFB-PML組24 h時GFB累計釋放率接近80%，至48 h仍持續(xù)釋放，緩釋效果明顯。

圖2 GFB(A)與GFB-PML(B)體外模擬釋放曲線(n=3)注：與GFB-PML組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 GFB-PML對A549細胞攝取與毒性影響 攝取結(jié)果見圖3～4。綠色熒光為細胞攝取C6-PML后顯示的熒光，藍色熒光為細胞核染色后顯示的熒光，紅色熒光為細胞骨架染色后顯示的熒光。綠色熒光越強，表明細胞攝取越多C6-PML。熒光在細胞質(zhì)內(nèi)均有分布，圖3顯示，在相同濃度下(500 μg·mL-1)，隨攝取時間增加，綠色熒光強度增強，表明細胞攝取更多C6-PML，細胞對脂質(zhì)體的攝取呈時間依賴性；圖4顯示，在相同攝取時間下(4 h)，C6-PML濃度越高，綠色熒光強度增強，攝取呈濃度依賴性。由此可以看出，細胞對GFB-PML的攝取呈現(xiàn)出時間和濃度雙重依賴性。

圖3 不同攝取時間下C6-PML在A549細胞內(nèi)攝取情況(比例尺為20 μm)

圖4 不同濃度C6-PML在A549細胞內(nèi)攝取情況(比例尺為20 μm)

細胞毒性結(jié)果如圖5～6。圖5為PML作用于A549細胞毒性結(jié)果，PML在高達1 000 μg·mL-1時對細胞幾乎無毒性，表明PML安全性好，細胞順應性高。圖6為GFB和GFB-PML對A549細胞毒性結(jié)果，在低濃度下(0.01 ～ 1 μg·mL-1)，GFB原料藥組對細胞毒性不明顯，說明游離原料藥入胞能力較差，在低濃度時對細胞抑制作用較??；GFB-PML組顯示出較高的細胞殺傷性，細胞存活率顯著低于GFB組(P<0.05)，表明GFB-PML能攜帶GFB入胞，增加了GFB對A549細胞的殺傷性。同時在較高濃度下GFB-PML組細胞存活率低于GFB組(P<0.05)，結(jié)合GFB-PML體外釋放結(jié)果，可看出GFB-PML能延長GFB在細胞內(nèi)作用時間，增加細胞對GFB的攝取，進而提高GFB對A549細胞抑制效果。

圖5 PML對A549細胞毒性結(jié)果(n=6)

圖6 GFB(A)與GFB-PML(B)對A549細胞毒性結(jié)果(n=6)注：兩組間比較，*P<0.05

2.4 GFB-PML對小鼠腫瘤生長的影響 H22荷瘤小鼠腫瘤生長趨勢如圖7，各組小鼠腫瘤體積均隨給藥時間而增長，第0至第2天腫瘤生長較為緩慢。從第4 天開始，生理鹽水組與PML組腫瘤體積增長較快，兩組體積無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。GFB組第4、6、8 d與生理鹽水組相比，腫瘤體積大小有所降低，兩組體積無統(tǒng)計學差異(P=0.881、0.443、0.224)。GFB-PML組與生理鹽水組對比，3次測量的腫瘤體積均降低，有統(tǒng)計學差異(P=0.028、0.024、0.009)，對腫瘤生長有較強抑制作用。小鼠處死后解剖瘤體，生理鹽水組瘤重為(6.83 ± 0.87)g，PML組瘤重為(5.85±1.88)g，與生理鹽水組相比，無統(tǒng)計學差異(P=0.973)；GFB組瘤重為(4.28±1.72)g，與生理鹽水組相比，有統(tǒng)計學差異(P=0.016)；GFB-Lip組瘤重為(3.64±2.00)g，與生理鹽水組相比，有統(tǒng)計學差異(P=0.001)。GFB組抑瘤率為37.34%，GFB-PML組抑瘤率為46.71%?？梢钥闯?，GFB-PML能增強GFB抑制腫瘤生長的效果。

圖7 H22荷瘤小鼠腫瘤生長曲線(n=8)注：與生理鹽水組對比，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

傳統(tǒng)磷脂、膽固醇通過薄膜分散法制備的脂質(zhì)體包封率較低，包封率值為50%～80%[13]；本文利用泊洛沙姆407修飾脂質(zhì)體，包封率明顯提高。相比于泊洛沙姆188，有研究顯示隨泊洛沙姆188含量增加，包封率值沒有顯著性改變[14]，顯示出泊洛沙姆407應用于脂質(zhì)體載藥時具有提高包封率的優(yōu)勢。制備的脂質(zhì)體于4 ℃冰箱放置12 h，沒有出現(xiàn)沉降現(xiàn)象，穩(wěn)定性較好。

制備的GFB-PML在粒徑測定時由于濃度較大，脂質(zhì)體之間出現(xiàn)了重疊，而納米粒度測定儀難以分辨，造成測定粒徑結(jié)果較透射電鏡觀察結(jié)果偏大。體外釋放實驗中，我們選擇磷酸鹽緩沖液作為釋放介質(zhì)，但由于GFB在中性pH值的磷酸鹽緩沖液中幾乎不溶，所以加入30%(V/V)的甲醇溶液，增加GFB在介質(zhì)中的溶解度[15]。由于本實驗制備的GFB-PML包封率高，能有效降低突釋現(xiàn)象，發(fā)揮緩釋效果。體外細胞攝取實驗從時間和濃度兩方面說明細胞對脂質(zhì)體的攝取有時間和劑量依賴性。細胞毒性實驗中，相同濃度下GFB-PML比GFB原料藥對A549細胞殺傷性更強，可理解為GFB-PML增加了GFB穿過細胞膜的能力，運載GFB進入細胞內(nèi)并作用于ATP位點，阻斷信號傳導，從而抑制A549細胞的繁殖、轉(zhuǎn)移[16]。

有研究以100 mg·kg-1劑量的吉非替尼灌胃方式考察吉非替尼對肝癌H22小鼠的腫瘤作用[17]。本文建立了H22小鼠肝癌腹水腫瘤模型，進行了GFB-PML對肝癌H22小鼠腫瘤生長抑制實驗，以6 mg·kg-1的給藥劑量，尾靜脈注射方式給藥，考察GFB-PML的腫瘤抑制效果。結(jié)果可見，制備的GFB-PML對小鼠腫瘤生長有較強的抑制作用，增強了GFB的抗腫瘤效果。同時對比大劑量灌胃方式，低劑量注射給藥也顯現(xiàn)出較顯著的抑瘤效果，為吉非替尼拓展新劑型應用奠定基礎。