傳統(tǒng)食品酸粥的發(fā)酵工藝

秦慧彬，黃志偉，張志強，張茜茜，李東航，喬治軍，楊洪江*

1(天津科技大學 生物工程學院，工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津，300457)2(山西省農業(yè)科學院 農作物品種資源研究所，農業(yè)部黃土高原基因資源與種質創(chuàng)制重點實驗室，雜糧種質資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西 太原，030001)

谷物發(fā)酵食品是通過各種天然發(fā)酵過程，由乳酸菌、酵母等有益微生物對稻類、麥類、豆菽類以及薯類等原料進行發(fā)酵，使其營養(yǎng)成分發(fā)生改變并產(chǎn)生獨特風味的食品。與原料直接烹飪的食物相比，谷物發(fā)酵食品不僅增加了食物的保質期，而且通常更加可口、易消化，并且富含各種營養(yǎng)成分，如維生素、有機酸和自由氨基酸等[1]。谷物發(fā)酵食品按照發(fā)酵過程可以分為酒精型發(fā)酵和有機酸型發(fā)酵。酵母是酒精型發(fā)酵過程中的主要微生物，代表性發(fā)酵產(chǎn)品有米酒、黃酒、白酒、啤酒等各種酒類。有機酸型發(fā)酵包含乳酸發(fā)酵和乙酸發(fā)酵。乳酸發(fā)酵產(chǎn)品包括發(fā)酵的牛奶和谷物，主要微生物為乳酸菌。醋酸菌也是重要的食品微生物，在氧氣過剩的條件下，醋酸菌可以將乙醇轉化為乙酸，代表性發(fā)酵產(chǎn)品有食醋等[2]。

酸粥是我國西北地區(qū)傳統(tǒng)的有機酸型發(fā)酵食品，由糜米為主要原料自然發(fā)酵而成，在當?shù)乇蛔鳛榍鍥鼋馐畹募哑罚哂休^大的市場發(fā)展?jié)摿?。但是，酸粥制作一般在家庭中完成，沒有形成規(guī)模化生產(chǎn)，存在著一定的安全風險。在先前的研究中，采集了59份山西省河曲縣和偏關縣的家庭自制的酸粥樣品，對酸粥中的乳酸、乙酸和自由氨基酸進行了測定，結合微生物分離方法與宏基因組測序技術，對酸粥中微生物菌群的多樣性進行了系統(tǒng)分析，明確了酸粥中主要微生物種類和豐度；并從中分離鑒定了多株乳酸菌、醋酸菌和酵母[3]。乳酸菌是酸粥發(fā)酵的主要菌種。

國內有研究人員先后從各種酸粥樣品中分離了多種乳酸菌，并對分離菌株的性質特別是抑菌活性進行了分析[4-8]。乳酸菌在腸道中的定殖能力與其合成生物被膜的能力具有相關性，生物被膜量越多，乳酸菌定殖腸道比例越高。在自然界中，微生物通過形成生物被膜，抵御包括極端溫度、pH、滲透壓、營養(yǎng)損耗等多種環(huán)境壓力，增加生存的幾率。在體內，形成生物被膜的細菌能夠免遭免疫或藥物清除[9]。益生菌具有在腸道中良好的定殖能力，研究表明微生物合成生物被膜的水平與其在腸道的定殖能力呈正相關性[10]。據(jù)此，本研究將乳酸菌合成生物被膜的水平作為選擇發(fā)酵菌株的重要標準。通過分析來自酸粥的乳酸菌菌株生產(chǎn)生物被膜能力、耐酸性、耐高溫和抑菌性，從210株乳酸菌菌株中選擇1株表現(xiàn)優(yōu)異的戊糖乳桿菌(L.pentosus)h8-c作為出發(fā)菌株進行實驗室酸粥的發(fā)酵工藝研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵菌株分離自山西省忻州市河曲縣的酸粥樣品，包括戊糖乳桿菌(L.pentosus)h8-c、庫茲威爾畢赤酵母(P.kudriavzevii)h8-a和醋酸菌(A.lavaniensis)h8-b，均保存于山西省農業(yè)科學院農作物品種資源研究所微生物實驗室。實驗所用糜米為河曲縣主要地方品種“白糜子”，大米、小米購于當?shù)爻?；YEPD[11]、GYC[12]、MRS[13]培養(yǎng)基、BHI[14]培養(yǎng)基按照文獻所述進行配制。“AccQ-Fluor”試劑，美國Waters公司，氨基酸混合標準品AAS18和色氨酸標準品A9906，美國Sigma-Aldrich有限公司。

1.2 儀器與設備

5804R低溫高速離心機，德國eppendorf公司；dragonlab MX-S漩渦振蕩器，大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司；HYQ60氣浴恒溫振蕩器，武漢匯誠生物科技有限公司；MIR-554生化培養(yǎng)箱，日本三洋公司；SX-500高壓滅菌器，日本TOMY公司；SW-CJ-2FD無菌操作臺，蘇州蘇潔凈化設備有限公司；Directq-3純水機，美國Millipore公司；Synergy H1酶標儀，美國BIOTEK公司；PB-10 pH計，德國賽多利斯科技儀器有限公司；SBA-40D生物傳感儀，濟南柏盛生物科技有限公司；超高效液相色譜儀(配有PDA檢測器)，美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌h8-c生長曲線的繪制

將戊糖乳桿菌h8-c單菌落接入MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)12 h后。以3%接種量轉接至96微孔板中，每孔MRS培養(yǎng)基體積為250 μL。30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，每10 min測定其OD600吸光度值，并繪制乳酸菌的生長曲線。

1.3.2 接種量對糜米發(fā)酵的影響

在MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)菌株h8-c至對數(shù)期，6 000 r/min離心5 min，棄上清，使用生理鹽水重懸菌體，并調解菌體濃度至OD600為0.6～0.8作為發(fā)酵種子。稱取100 g淘洗晾干后的糜米放于1 L試劑瓶中，加入900 mL無菌水。將上述菌懸液作為種子轉接入糜米混合液中，接種量分別為1%、3%、5%、7%和9%，分別加入適量的無菌水，使糜米懸液的總體積均為1 L，每個接種量設置3個平行。

轉接后取初始發(fā)酵液20 mL，其中1 mL發(fā)酵液用于系列稀釋，涂布平板確定菌體數(shù)量，剩余發(fā)酵液經(jīng)過濾后用于測定乳酸含量。發(fā)酵過程中，每隔24 h取出20 mL發(fā)酵液用于確定菌濃和乳酸含量。乳酸含量使用生物傳感儀進行測定[3]。

1.3.3 糜米乳酸菌發(fā)酵的工藝優(yōu)化

發(fā)酵菌株為h8-c，原料為糜米，30 ℃持續(xù)發(fā)酵72 h，每隔24 h取20 mL發(fā)酵液用于測定乳酸、自由氨基酸含量，并對酸粥進行感官評價，同時每24 h將糜米換1次。發(fā)酵前采用不同方式處理糜米，包括：(A)糜米放入試劑瓶中，不做任何處理；(B)糜米放入試劑瓶中，加入400 mL無菌水，65 ℃水浴30 min；(C)糜米放入試劑瓶中，105 ℃處理15 min；(D)糜米加適量無菌水，煮沸15 min。發(fā)酵工藝如下：

糜米100 g→淘洗→瀝干→A/B/C/D處理→冷卻→加水至1 000 mL→接種發(fā)酵(每24 h換相同處理的糜米)72 h→每24 h取發(fā)酵液定量分析乳酸和自由氨基酸含量

氨基酸含量測定使用AQC柱前衍生反相超高效液相色譜法進行定量分析[3]。

1.3.4 不同谷物的乳酸菌發(fā)酵

發(fā)酵菌株為h8-c，原料分別為大米、小米、糜米、大米和小米(質量比1∶1)、大米和糜米(質量比1∶1)、小米和糜米(質量比1∶1)。30 ℃持續(xù)發(fā)酵48 h，每隔24 h取10 mL發(fā)酵液用于測定自由氨基酸含量，并進行感官評價。發(fā)酵工藝如下：

原料米20 g→淘洗→瀝干→加水至200 mL→接種發(fā)酵48 h→取發(fā)酵液定量分析氨基酸含量

1.3.5 乳酸菌、醋酸菌、酵母菌混合發(fā)酵

分別利用YEPD、GYC和MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)畢赤酵母h8-a、醋酸菌h8-b和戊糖乳桿菌h8-c至OD600值達到0.6～0.8，6 000 r/min離心5 min，棄上清，以相同體積的生理鹽水重懸細菌。菌懸液作為種子以1%接種量轉接至糜米中，30 ℃持續(xù)發(fā)酵48 h，每隔4 h取20 mL發(fā)酵液用于測定乳酸、自由氨基酸含量，并進行感官評價，發(fā)酵24 h時換米。發(fā)酵工藝如下：

糜米100 g→淘洗→瀝干→加水至1 000 mL→接種發(fā)酵48 h(發(fā)酵24 h時換米)→每4 h取發(fā)酵液定量分析菌體數(shù)量、乳酸含量和氨基酸含量

1.3.6 感官評價

選取不同年齡階段的品評人員10人，對酸粥樣品進行評分，包括成品的風味、口感、色澤和外觀結構4個方面[15]。

2 結果與分析

2.1 戊糖乳桿菌h8-c的生長曲線

本研究定量分析了210株乳酸菌分離菌株合成的生物被膜，發(fā)現(xiàn)戊糖乳桿菌h8-c合成生物被膜的水平最高，約為其他菌株平均水平的10倍。并且該菌株在耐酸性、耐高溫和抑菌性方面都表現(xiàn)很好。通過分析該菌株的生長曲線，發(fā)現(xiàn)h8-c菌株在MRS培養(yǎng)基中延遲期較短，2 h后即進入對數(shù)生長期，具有較快的生長速度(圖1)。菌株h8-c被選擇為發(fā)酵菌株，在實驗室進行酸粥發(fā)酵的工藝研究。

圖1 戊糖乳桿菌h8-c的生長曲線Fig.1 The growth curve of Lactobacillus pentose h8-c

2.2 乳酸菌接種量對發(fā)酵過程的影響

培養(yǎng)菌株h8-c以不同接種量轉接入糜米中，分析乳酸菌數(shù)量和乳酸含量的變化。使用SPSS 18.0軟件對相同發(fā)酵時間不同接種量進行發(fā)酵的菌體數(shù)量進行一階方差分析，在5%顯著水平條件下，發(fā)酵起始階段(0 h)，以5%和7%接菌量進行發(fā)酵的菌體數(shù)量差異不顯著，其余接種量兩兩之間相互比較菌體數(shù)量均有顯著差異，而發(fā)酵24、48和72 h時，使用不同接菌量發(fā)酵的菌體數(shù)量之間均無顯著差異(圖2-a)。在發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長乳酸含量不斷增長，發(fā)酵0～24 h乳酸含量增長最多。使用方差分析表明，以不同接菌量進行發(fā)酵實驗，在發(fā)酵0 h，以5%和7%接菌量進行發(fā)酵，乳酸含量差異不顯著，其余接菌量乳酸含量差異顯著。發(fā)酵24和48 h時，7%接菌量與其他接菌量發(fā)酵乳酸含量差異顯著，其余接菌量發(fā)酵的乳酸含量差異不顯著，在發(fā)酵72 h時，所有接菌量發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸含量差異不顯著(圖2-b)。根據(jù)以上結果分析，使用1%的接菌量進行后續(xù)實驗，對應的初始菌體數(shù)量為(7.06±0.05)lgCFU/mL，發(fā)酵72 h后菌濃為(7.65±0.20)lgCFU/mL；發(fā)酵初始的乳酸含量為(3.33±2.36)μg/mL，發(fā)酵72 h后乳酸含量增加到(166.67±4.71)μg/mL。

a-菌株h8-c在酸粥發(fā)酵中的數(shù)量變化；b-不同接菌量發(fā)酵液中乳酸含量的變化圖2 接種量對酸粥發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of inoculum size effects on Suanzhou fermentations

2.3 糜米處理方式對酸粥發(fā)酵的影響

對糜米發(fā)酵前處理分別采用生米不處理、65 ℃水浴處理30 min、105 ℃處理15 min或100 ℃煮沸處理15 min四種方式。發(fā)酵結果如圖3所示。

a-四種不同處理的糜米對乳酸含量的影響；b-四種不同處理的糜米對自由氨基酸含量的影響A-生米發(fā)酵；B-65 ℃水浴處理30 min；C-105 ℃處理15 min；D-100 ℃煮沸處理15 min圖3 糜米處理方式對酸粥發(fā)酵的影響Fig.3 Treatment effects of proso millet on the Suanzhou fermentations

在發(fā)酵過程中，4種不同的處理方法都表現(xiàn)為發(fā)酵24 h乳酸含量明顯增加，發(fā)酵24 h后乳酸含量增加不明顯。糜米發(fā)酵前經(jīng)65 ℃水浴30 min處理的情況下，乳酸含量最高。生米發(fā)酵液自由氨基酸含量最高，且隨著發(fā)酵時間的延長不斷增加。而經(jīng)過高壓滅菌或煮沸處理的糜米再通過發(fā)酵過程會影響自由氨基酸的生成。感官評價結果顯示，以1%接菌量進行生米發(fā)酵48 h的酸粥風味最佳，酸度適口；發(fā)酵72 h后，顆粒完整、酸湯色澤成乳白色、酸香味濃郁；經(jīng)過水浴、高壓或煮沸處理后，糜米顆粒有不同程度的破損，高壓和蒸煮后的糜米顆粒破損嚴重，酸湯較渾濁。所以，在乳酸菌發(fā)酵酸粥的工藝路線中，仍然應該選擇生米發(fā)酵的路線，發(fā)酵48 h時自由氨基酸含量較高，達到177.23 μg/mL。

2.4 菌株h8-c發(fā)酵不同的谷物

以乳酸菌h8-c為發(fā)酵菌株，對不同谷物進行酸粥發(fā)酵研究。酸粥發(fā)酵使用的不同谷物或組合，包括：大米、小米、糜米、大米小米1∶1混合、大米糜米1∶1混合、小米糜米1∶1混合。

實驗結果顯示，發(fā)酵48 h后，單種谷物發(fā)酵酸粥產(chǎn)生總的自由氨基酸和必需氨基酸的能力由大到?。盒∶?大米>糜米，混合發(fā)酵酸粥中大米與小米的組合自由氨基酸含量最高(圖4)。小米發(fā)酵酸粥在氨基酸含量和各種氨基酸分布上都表現(xiàn)優(yōu)良，而糜米則在短時間純菌發(fā)酵中的表現(xiàn)并不太好，這與傳統(tǒng)老湯發(fā)酵中乳酸、自由氨基酸含量不斷積累的情況不同。酸粥中丙氨酸含量在所有氨基酸含量中最高，或許與酸粥特有的風味有關。

a-不同原材料乳酸菌發(fā)酵自由氨基酸總量發(fā)酵前后變化；b-不同原材料乳酸菌發(fā)酵必需氨基酸總量發(fā)酵前后變化；c-不同原材料乳酸菌發(fā)酵丙氨酸含量發(fā)酵前后變化圖4 不同谷物原料對酸粥發(fā)酵的影響Fig.4 Characterization of Suanzhou products fermented with different cereals

2.5 混菌發(fā)酵糜米酸粥

為了分析醋酸菌和酵母菌對酸粥發(fā)酵的影響，選擇了乳酸菌h8-c、醋酸菌h8-b和酵母菌h8-a作為發(fā)酵菌株進行混菌發(fā)酵，原料為糜米生米，與自然發(fā)酵相似，發(fā)酵周期為48 h。

酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的初始菌數(shù)分別為(4.35±0.06)lg CFU/mL,(5.02±0.02)lg CFU/mL,(5.38±0.07)lg CFU/mL。繪制發(fā)酵48 h的生長曲線，從圖5-a可以看出，酵母在生長初期菌體生長速度較快，發(fā)酵12 h酵母數(shù)量為發(fā)酵0 h的10倍，而發(fā)酵12～24 h階段，酵母數(shù)量維持穩(wěn)定，數(shù)量平均在(5.71±0.07)lg CFU/mL，發(fā)酵24～48 h，酵母菌的數(shù)量呈緩慢下降趨勢。醋酸菌在發(fā)酵的前12 h菌體數(shù)量沒有明顯增長，平均維持在(4.95±0.13)lg CFU/mL，在發(fā)酵12～48 h，醋酸菌數(shù)量緩慢增長，從(5.67±0.12)lg CFU/mL增長到(6.47±0.15)lg CFU/mL。乳酸菌在發(fā)酵48 h過程中持續(xù)增長，發(fā)酵48 h時，乳酸菌的菌體數(shù)量為(8.09±0.16)lg CFU/mL。

總體來看，發(fā)酵過程中占主導優(yōu)勢的菌株為乳酸菌，菌體數(shù)量占優(yōu)勢地位。在發(fā)酵過程的前12 h，由于醋酸菌生長緩慢，對乳酸菌和酵母菌沒有抑制作用，乳酸菌和酵母菌的增長速度比較快，且乳酸菌和酵母菌之間表現(xiàn)出協(xié)同增長的趨勢。發(fā)酵12 h后，當醋酸菌生長速率提高時，乳酸菌和酵母菌的生長速率受到不同程度的抑制，乳酸菌表現(xiàn)出生長緩慢，酵母菌的數(shù)量則開始下降。

在發(fā)酵過程中，氨基酸含量隨著發(fā)酵時間的延長持續(xù)增加，發(fā)酵48 h后，總的氨基酸質量濃度達到48 μg/mL，乳酸質量濃度達到1 750 μg/mL。在自由氨基酸中丙氨酸含量尤為突出，發(fā)酵48 h后達到13 μg/mL，占總的氨基酸含量的27%。生米混菌發(fā)酵48 h后，糜米顆粒較完整，酸湯呈淡乳白色，酸香味較純乳酸菌發(fā)酵略淡，口味沒有明顯差別。

3 結論

本研究分別以乳酸、自由氨基酸和感官評價得分為綜合評價指標，對不同原料和不同工藝發(fā)酵的酸粥產(chǎn)品進行了分析。本研究結果顯示，在多種酸粥產(chǎn)品中，單一乳酸菌發(fā)酵酸粥的生產(chǎn)工藝以生米發(fā)酵為最優(yōu)，發(fā)酵48 h可以達到口味最佳；以不同原材料發(fā)酵酸粥，以小米表現(xiàn)為最優(yōu)，未來開發(fā)快速發(fā)酵酸粥工業(yè)產(chǎn)品，應該考慮以小米為主的混合谷物進行發(fā)酵酸粥?；旌暇臧l(fā)酵酸粥，成品酸香味略淡，感官評價得分與純菌發(fā)酵沒有顯著差異，該結果與其他科研人員研究結果相似[15-16]。在未來的研究中，還將研發(fā)可直接食用的酸粥產(chǎn)品，該產(chǎn)品富含活的乳酸菌，可以作為益生菌定殖人體腸道，發(fā)揮益生作用。

a-混菌糜米發(fā)酵微生物數(shù)量變化；b-混菌糜米發(fā)酵乳酸含量變化;c-混菌糜米發(fā)酵氨基酸總量變化；d-混菌糜米發(fā)酵丙氨酸總量變化圖5 混合菌株發(fā)酵糜米對酸粥的影響Fig.5 Characterization of Suanzhou products fermented with mixed starting strains from proso millet