泡豇豆發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸變化及對(duì)亞硝酸鹽降解的影響

徐柯，成林林，袁美，喬聰聰，曾凡坤,2*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715)

豇豆(Vignasinensis)又被稱為豆角，因其含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分：葉綠素(160 mg/kg)、VC(190 mg/kg)、有機(jī)酸(0.2%)、蛋白質(zhì)(1.5%)、可溶性固形物(10.15%)，被稱作“蔬菜中的肉類”[1]。但由于豇豆呼吸強(qiáng)度大于普通蔬菜，采收后如果不及時(shí)處理很容易萎蔫、褪色、腐爛，因此鮮豇豆采摘后需及時(shí)處理以減少損耗[2]。

泡菜是一種歷史悠久、營(yíng)養(yǎng)豐富的乳酸發(fā)酵蔬菜制品，其有機(jī)酸含量的變化既是評(píng)價(jià)發(fā)酵工藝的重要指標(biāo)，也是泡菜生產(chǎn)過(guò)程中重要的質(zhì)量管理指標(biāo)[3]。食品中廣泛存在的有機(jī)酸大多為低分子羧酸，除乙酸、乳酸、丁二酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸外，還有少量的富馬酸、馬來(lái)酸、甲酸、草酸等[4-5]。這些有機(jī)酸既為食品提供特殊的風(fēng)味，也作為酸性物質(zhì)調(diào)節(jié)溶液pH使亞硝酸鹽發(fā)生降解[6]。目前有機(jī)酸的研究多集中在水果[7-9]，對(duì)于蔬菜中有機(jī)酸的研究甚少；且基本也只對(duì)泡菜原料中的有機(jī)酸進(jìn)行研究，而對(duì)泡菜發(fā)酵液中有機(jī)酸的報(bào)道較為罕見(jiàn)；鮮有的幾篇也僅列出不同發(fā)酵天數(shù)有機(jī)酸的含量變化數(shù)據(jù)，并未對(duì)現(xiàn)象進(jìn)行解釋，更未對(duì)其中的原理進(jìn)行探討[10-12]。因此明確泡菜發(fā)酵過(guò)程中原料及發(fā)酵液中有機(jī)酸種類、含量變化及其對(duì)亞硝酸鹽的降解作用，為泡菜研究提供新的方向。

本試驗(yàn)以新鮮豇豆為原料，試圖探索泡豇豆發(fā)酵過(guò)程中蔬菜組織和發(fā)酵液中有機(jī)酸的種類及含量變化，并比較各有機(jī)酸降解亞硝酸鹽能力大小，以期為闡明泡菜中亞硝酸鹽降解機(jī)理和生產(chǎn)控制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

豇豆、食鹽、玻璃壇，均購(gòu)于重慶市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

有機(jī)酸(草酸、酒石酸、蘋果酸、醋酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸)、NH4H2PO3、H3PO4、甲醇，均為色譜純；亞硝酸鹽、NaOH、(NH4)2SO4、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺，均為分析純，成都科龍化工試劑廠。

1.2 主要儀器及設(shè)備

PB-10酸度計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；UV-1000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海大美科學(xué)儀器有限公司；5810臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；FM200高速分散機(jī)，上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜腌制方法

豇豆→清洗→切分→裝壇→按1∶1加入8%食鹽水→用水密封→22 ℃恒溫發(fā)酵

每24 h取一壇進(jìn)行分析，每個(gè)樣品試驗(yàn)3次。

1.3.2 亞硝酸鹽測(cè)定

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，豇豆原料中硝酸鹽含量為426.11 mg/kg。亞硝酸含量測(cè)定參照GB 5009.33—2016[13]，采用分光光度法。吸光值y與亞硝酸鹽含量x的方程為：y=0.014 3x-0.001 8，R2=0.998 8。

1.3.3 泡菜中有機(jī)酸測(cè)定

(1)標(biāo)樣配制

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)將草酸、酒石酸、蘋果酸、醋酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸8種有機(jī)酸分別配制成5種不同濃度，制成混標(biāo)。

(2)樣品處理

豇豆按1∶1加超純水，制備成勻漿。分別稱取5.00 g勻漿，加入15 mL 80%乙醇-水溶液，75 ℃水浴0.5 h，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，超純水定容至刻度，過(guò)濾，濾液于9 000 r/min，離心30 min，上清液用氮吹儀濃縮至1.00 mL，用0.45 μm水系濾膜針頭過(guò)濾器過(guò)濾濃縮液，將濾液上機(jī)檢測(cè)[14]。發(fā)酵液直接取原液過(guò)0.45 μm水系濾膜，濾液上機(jī)檢測(cè)。

(3)測(cè)定條件

色譜柱：C18柱(Welch Materials)，250 mm×4.6 mm，5 μm。流動(dòng)相：3% CH3OH，0.1mol/L KH2PO3，pH 2.8，臨用前超聲波脫氣30 min。流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫28 ℃。

(4)樣品定性與定量

在上述測(cè)定條件下，對(duì)比樣品測(cè)定圖譜與混標(biāo)測(cè)定圖譜，通過(guò)保留時(shí)間進(jìn)行定性分析。通過(guò)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品所對(duì)應(yīng)的峰面積制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

(5)結(jié)果計(jì)算如公式(1)

(1)

式中：X，樣品中有機(jī)酸含量，mg/(100 g)；c，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得有機(jī)酸的濃度，μg/mL；V1，樣品最后定容體積，mL；V，提取液總體積，mL；V2，樣品進(jìn)樣體積，mL；m，樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 不同有機(jī)酸降解亞硝酸能力

分別取20.00 mg草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸，加至40 mL，50μg/mL亞硝酸鹽溶液中。30 ℃水浴，每12 h取1 mL于25 mL比色管中，測(cè)定亞硝酸鹽含量。并按公式(2)計(jì)算亞硝酸鹽降解率。

(2)

式中：Y，亞硝酸鹽降解率，%；m0，未加有機(jī)酸時(shí)亞硝酸鹽含量，μg；m，加入有機(jī)酸時(shí)亞硝酸鹽含量，μg。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均為3次試驗(yàn)的平均值，采用Excel和Origin 9.0進(jìn)行處理。

2 結(jié)果分析

2.1 蔬菜腌制過(guò)程中亞硝酸鹽的變化

如圖1所示,原料中亞硝酸鹽含量為1.79 mg/kg，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，蔬菜組織和發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量均呈先升高后下降的趨勢(shì)，3 d后出現(xiàn)“亞硝峰”，亞硝酸鹽含量分別為27.44 mg/kg和28.92 mg/kg，隨后迅速下降，7 d后蔬菜組織和發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量降至較低水平，分別為1.50 mg/kg和1.67 mg/kg，達(dá)到綠色食品標(biāo)準(zhǔn)(<4 mg/kg)。

圖1 蔬菜發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量變化Fig.1 Changes of the nitrite contents in vegetables and brine during the fermentation

2.2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜和樣品圖譜

由圖2可以看出，采用此方法能較好地分離8種有機(jī)酸，且在15 min左右時(shí)全部有機(jī)酸被洗脫出來(lái)。

圖2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of a mixture of eight organic acids standards注：1-草酸；2-酒石酸；3-蘋果酸；4-乳酸；5-乙酸；6-檸檬酸；7-富馬酸；8-琥珀酸，下同。

由圖3可知發(fā)酵2 d后在蔬菜組織和發(fā)酵液中均檢測(cè)出8種有機(jī)酸，分別是草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸。發(fā)酵7 d后在蔬菜組織中檢出6種有機(jī)酸，草酸和富馬酸未檢出；發(fā)酵液中也檢出6種有機(jī)酸，富馬酸和琥珀酸未檢出(見(jiàn)圖4)?？梢?jiàn)，蔬菜組織和發(fā)酵液中有機(jī)酸種類及含量隨發(fā)酵時(shí)間有明顯的變化。

a-蔬菜組織組；b-發(fā)酵液組圖3 發(fā)酵2d蔬菜組織中和發(fā)酵液中有機(jī)酸色譜圖Fig.3 Chromatogram of organic acids in vegetables and brine at the 2rd day

a-蔬菜組織組；b-發(fā)酵液組圖4 發(fā)酵7d蔬菜組織和發(fā)酵液中有機(jī)酸色譜圖Fig.4 Chromatogram of organic acids in vegetables and brine at the 7th day

2.3 發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量變化

2.3.1 發(fā)酵過(guò)程中草酸含量變化

從泡菜發(fā)酵過(guò)程中草酸含量變化(圖5)來(lái)看，新鮮豇豆中草酸含量為225.88 mg/(100 g)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，蔬菜組織中草酸含量總體呈顯著降低趨勢(shì)(P<0.01)，到發(fā)酵第5天時(shí)未被檢出。原因可能是草酸與醇類物質(zhì)反應(yīng)生成酯類物質(zhì)，或被微生物利用生成其他物質(zhì)[15]，以及計(jì)入發(fā)酵液中導(dǎo)致其含量降低。而發(fā)酵液中草酸含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行先升高后降低(P<0.05)，在發(fā)酵第7天，草酸含量降至29.32 mg/(100 g)。豇豆經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵作用可顯著降低草酸含量，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

圖5 發(fā)酵過(guò)程中草酸含量變化Fig.5 Changes of oxalic acid in vegetables and brine during fermentation

2.3.2 發(fā)酵過(guò)程中酒石酸含量變化

原料中酒石酸含量為76.92 mg/(100 g)，隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，蔬菜組織中酒石酸含量發(fā)酵1 d后顯著降低(P<0.05)，再升高，發(fā)酵第3天酒石酸含量最高，為97.93 mg/(100 g)，而發(fā)酵7 d后降至49.69 mg/(100 g)(圖6)。發(fā)酵液中酒石酸含量變化呈升高后降低的趨勢(shì)(P<0.05)，發(fā)酵4 d后酒石酸含量最高，為83.71 mg/kg，發(fā)酵7 d后降至45.43 mg/(100 g)。

圖6 發(fā)酵過(guò)程中酒石酸含量變化Fig.6 Changes of tartaric acid in vegetables and brine during fermentation

2.3.3 發(fā)酵過(guò)程中蘋果酸含量變化

在泡菜中蘋果酸含量相對(duì)較高，使得泡菜的口感令人愉悅。如圖7所示,在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，蔬菜組織和發(fā)酵液中蘋果酸含量顯著升高(P<0.05)，新鮮蔬菜中蘋果酸含量為28.78 mg/(100 g)，發(fā)酵7 d后為328.88 mg/(100 g)。發(fā)酵液中蘋果酸在發(fā)酵2 d后開(kāi)始被檢出，然后顯著升高(P<0.05)，發(fā)酵5 d后，蘋果酸含量變化趨勢(shì)不明顯，發(fā)酵7 d后，含量為195.38 mg/(100 g)。蔬菜組織中的蘋果酸含量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中較發(fā)酵液中高。

圖7 發(fā)酵過(guò)程中蘋果酸含量變化Fig.7 Changes ofmalic acid in vegetables and brine during fermentation

2.3.4 發(fā)酵過(guò)程中乳酸含量變化

從泡菜發(fā)酵過(guò)程中蔬菜組織和發(fā)酵液中乳酸含量變化(圖8)來(lái)看，原料中乳酸含量較低，為3.61 mg/(100 g)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行蔬菜組織中乳酸含量呈曲折上升趨勢(shì)。蔬菜經(jīng)發(fā)酵，乳酸含量提高8倍多。乳酸酸味柔和，有后酸味，提供泡菜柔和的風(fēng)味[16]。發(fā)酵液中乳酸在發(fā)酵2 d后開(kāi)始被檢出，呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，發(fā)酵6 d后乳酸含量最高，為79.13 mg/(100 g)，7 d后降至63.19 mg/(100 g)。原因可能是在發(fā)酵的初始階段，主要進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵；而在發(fā)酵中期，主要是同型乳酸發(fā)酵，該階段乳酸菌較活躍，此時(shí)可積累大量的乳酸；在發(fā)酵后熟階段，酯化反應(yīng)生成酯類芳香物質(zhì)，乳酸菌活性降低，乳酸含量降低[17]。

圖8 發(fā)酵過(guò)程中乳酸含量變化Fig.8 Changes oflactic acid in vegetables and brine during the fermentation

2.3.5 發(fā)酵過(guò)程中乙酸含量變化

蔬菜發(fā)酵過(guò)程中，好氣性醋酸菌將生成的乙醇在乙醇脫氫酶和氧氣的作用下先氧化為乙醛，然后再氧化為醋酸。產(chǎn)生的醋酸具有較強(qiáng)的刺激感，并具有增酸增香特性，促進(jìn)食欲[18]。原料中乙酸含量較低，為7.93 mg/(100 g)。隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，蔬菜組織和發(fā)酵液中乙酸含量顯著升高(P<0.05，如圖9)。蔬菜組織中乙酸發(fā)酵第3天增速最快，發(fā)酵6 d后，含量保持不變，為364.71 mg/(100 g)。發(fā)酵液中乙酸含量升高速率較緩，在發(fā)酵6 d后最高，為128.43 mg/(100 g)，發(fā)酵第7天，乙酸含量下降至107.66 mg/(100 g)。

圖9 發(fā)酵過(guò)程中乙酸含量變化Fig.9 Changes of acetic acid in vegetables and brine during fermentation

2.3.6 發(fā)酵過(guò)程中檸檬酸含量變化

原料中檸檬酸含量為118.02 mg/(100 g)，泡菜發(fā)酵過(guò)程中蔬菜組織中的檸檬酸含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)(P<0.05)。在三羧酸循環(huán)階段會(huì)積累檸檬酸，隨著發(fā)酵的繼續(xù)，部分檸檬酸被代謝，使其含量趨于平衡[19]。發(fā)酵4 d含量最高，為743.12 mg/(100 g)，7d后降至641.59 mg/(100 g)，泡菜經(jīng)過(guò)發(fā)酵檸檬酸增加了4.4倍(圖10)。發(fā)酵液中檸檬酸含量在發(fā)酵前4 d增速緩慢，第5天增加較高，最后基本保持不變，最終含量為174.48 mg/(100 g)。

圖10 發(fā)酵過(guò)程中檸檬酸含量變化Fig.10 Changes ofcitric acidin vegetables and brine during fermentation

2.3.7 發(fā)酵過(guò)程中富馬酸含量變化

蔬菜組織和發(fā)酵液中富馬酸含量均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，發(fā)酵后期均未檢出(如圖11),發(fā)酵3d后蔬菜組織中富馬酸含量最高，為1.27 mg/(100 g)。發(fā)酵4 d后發(fā)酵液中富馬酸含量最高，為1.70 mg/(100 g)。富馬酸含量顯著下降，可能是被醋酸菌代謝利用或者在發(fā)酵的強(qiáng)氧化條件下被氧化降解。

圖11 泡菜發(fā)酵過(guò)程中富馬酸含量變化Fig.11 Changes of fumaric acid in vegetables and brine during the fermentation

2.3.8 發(fā)酵過(guò)程中琥珀酸含量變化

如圖12所示,蔬菜組織中琥珀酸含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行顯著增加(P<0.05)，發(fā)酵第7天含量為147.75 mg/(100 g)，比新鮮蔬菜提高了9倍左右，可能是由微生物代謝引起的。發(fā)酵液中琥珀酸含量先升高，至第3天達(dá)到最大，為28.44 mg/(100 g)，之后下降，發(fā)酵第4天及之后未被檢出?？赡苁怯捎阽晁崾侨人嵫h(huán)的中間產(chǎn)物，參與發(fā)酵過(guò)程中的微生物代謝，并與亞硝酸鹽反應(yīng)，以及生成微溶性鹽等導(dǎo)致其含量下降。

圖12 發(fā)酵過(guò)程中琥珀酸含量變化Fig.12 Changes of succinic acid in vegetables and brine during the fermentation

2.4 不同有機(jī)酸對(duì)亞硝酸鹽降解能力

如圖13所示,反應(yīng)12 h草酸降解率為89.36%，其次是酒石酸83.33%，蘋果酸和檸檬酸差異不大，分別為79.30%、78.22%，富馬酸降解能力最弱，降解率為15.48%。反應(yīng)72 h后，除乙酸、乳酸和富馬酸外，其他5種有機(jī)酸對(duì)亞硝酸鹽降解率均達(dá)95%以上。各有機(jī)酸降解亞硝酸鹽能力的大小順序依次為草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、乙酸、乳酸、富馬酸。

圖13 不同有機(jī)酸降解亞硝酸鹽能力比較Fig.13 Effect of different organic acids onscavenging rate of nitrite

3 結(jié)論與討論

豇豆發(fā)酵前期在蔬菜組織和發(fā)酵液中均檢測(cè)出8種有機(jī)酸，分別為草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸和琥珀酸；8種有機(jī)酸隨發(fā)酵時(shí)間的增加變化趨勢(shì)各不相同，發(fā)酵7 d后，蔬菜組織中檸檬酸含量最高，為641.59 mg/(100 g)，發(fā)酵液中蘋果酸含量最高，為195.39 mg/(100 g)；且各有機(jī)酸降解亞硝酸鹽能力大小順序依次為草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、乙酸、乳酸、富馬酸。其中，檸檬酸酸性較強(qiáng)，含量較高，降解亞硝酸鹽的能力較強(qiáng)，故推斷其在泡菜發(fā)酵過(guò)程可能對(duì)亞硝酸鹽的降解起主導(dǎo)作用。

本文與商景天等[10]、鄒輝等[11]和劉曉英等[12]的研究存在相似之處，但試驗(yàn)結(jié)果卻差別很大。具體原因可能有以下兩點(diǎn)：(1)原料不同。泡菜發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸種類及各有機(jī)酸含量與發(fā)酵的原料密切相關(guān)；(2)發(fā)酵時(shí)間不同。商景天等[10]的發(fā)酵時(shí)間為120 h，鄒輝等[11]、劉曉英等[12]的發(fā)酵時(shí)間為12 d，故不同的發(fā)酵時(shí)間，各有機(jī)酸含量的變化趨勢(shì)也會(huì)發(fā)生變化。本文雖與上述幾篇文章的研究?jī)?nèi)容存在相似點(diǎn)，但側(cè)重點(diǎn)有所不同。商景天等[10]、劉曉英等[12]重點(diǎn)研究不同條件(溫度、酸濃度、pH等)對(duì)有機(jī)酸降解亞硝酸鹽的影響，鄒輝等[11]重點(diǎn)測(cè)定泡白菜中的有機(jī)酸種類及它們各自對(duì)亞硝酸鹽的降解能力，但對(duì)各有機(jī)酸的含量變化只是簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)羅列，并未進(jìn)行深入分析。且3篇文章都只對(duì)泡菜進(jìn)行研究，都未將發(fā)酵液一起對(duì)比。因此，本文借鑒前人的研究情況，并在此基礎(chǔ)上深入，以期為闡明泡菜中亞硝酸鹽降解機(jī)理和生產(chǎn)控制提供理論基礎(chǔ)。