清香小曲白酒新工藝中微生物及環(huán)境因子對酒體風(fēng)味變化的影響

唐潔，陳申習(xí)，林斌，夏金陽，楊強(qiáng)*

1(勁牌有限公司，湖北 大冶，435100)2(勁牌研究院，湖北 大冶，435100)3(中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 大冶，435100)

傳統(tǒng)白酒釀造過程中存在著設(shè)備落后、勞動強(qiáng)度大、生產(chǎn)效率低、工藝控制粗放等問題，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和技術(shù)的創(chuàng)新，釀酒行業(yè)開始采用機(jī)械化、自動化、智能化和信息化等手段不斷地促使傳統(tǒng)白酒釀造模式升級[1-4]。機(jī)械化釀酒工藝雖然在酒曲應(yīng)用和釀造流程方面與傳統(tǒng)工藝相似，但因其獨(dú)特的釀造設(shè)備以及釀造環(huán)境，導(dǎo)致生產(chǎn)出來的原酒相比較傳統(tǒng)工藝，在風(fēng)味組成上具有顯著性差異。解析機(jī)械化釀酒工藝過程中風(fēng)味物質(zhì)形成和積累的驅(qū)動因子將有助于了解機(jī)械化釀酒工藝風(fēng)味物質(zhì)形成規(guī)律，最終達(dá)到機(jī)械化釀造出的原酒酒質(zhì)與傳統(tǒng)工藝保持一致甚至更優(yōu)的目標(biāo)。

作為白酒發(fā)酵過程中最重要的生物因子——微生物，代謝酒醅中淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，將其轉(zhuǎn)化為白酒的主要成分及微量風(fēng)味物質(zhì)。白酒發(fā)酵過程中微生物群落演替和結(jié)構(gòu)改變會驅(qū)動風(fēng)味物質(zhì)組成發(fā)生變化，引起從乙醇到乙酸等一系列呈香物質(zhì)生成和轉(zhuǎn)化[5]。同樣，微生物生長代謝引起了窖內(nèi)酒醅理化指標(biāo)呈現(xiàn)一定規(guī)律的變化，同時酒醅中成分改變也引起微生物群落生存環(huán)境和群落結(jié)構(gòu)的相應(yīng)改變，使窖內(nèi)優(yōu)勢菌群逐漸呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)[6]，進(jìn)而影響酒醅中風(fēng)味物質(zhì)代謝和積累。可見微生物和環(huán)境因子是影響白酒中風(fēng)味物質(zhì)形成的重要因素[7-8]。隨著勁牌小曲白酒機(jī)械化新工藝近年不斷完善和成熟，原酒品質(zhì)得到了極大的提高。但通過近幾年的原酒生產(chǎn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，原酒的出酒率和酒質(zhì)隨著釀造原料和季節(jié)的變化而產(chǎn)生差異。因此，揭示小曲清香型白酒機(jī)械化工藝過程中風(fēng)味物質(zhì)形成的驅(qū)動因子，不僅有助于探索清香型白酒穩(wěn)定生產(chǎn)工藝，更能進(jìn)一步了解小曲清香型白酒發(fā)酵過程中微生物變化及風(fēng)味產(chǎn)生機(jī)理。以往研究大多集中在濃香型或大曲清香型酒醅中微生物、理化指標(biāo)和風(fēng)味成分之間的研究[9-20]，而涉及小曲清香型白酒的研究甚少[4,21-25]。

本文以正常發(fā)酵清香型小曲機(jī)械化車間酒醅為研究對象，分析不同發(fā)酵時期酒醅發(fā)酵過程中微生物動態(tài)變化，以及風(fēng)味物質(zhì)生成的過程，并結(jié)合酒醅環(huán)境理化參數(shù)的變化，揭示了清香小曲白酒新工藝中微生物及環(huán)境因子對酒體風(fēng)味變化的影響，以期指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)，使原酒中各主要香味成分含量波動較小，為機(jī)械化工藝改進(jìn)和酒質(zhì)的不斷提升提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集

樣品采集于勁牌有限公司機(jī)械化白酒發(fā)酵車間酒醅，目前車間糖化時間1 d，發(fā)酵周期為15 d，一個發(fā)酵批次為16 d。選擇發(fā)酵0～15 d每天固定一個發(fā)酵槽車連續(xù)取樣。為了獲得不同時間發(fā)酵酒醅中各參數(shù)的變化，先后于2015年11～12月、2016年1～4月(2月除外)對同一個車間發(fā)酵過程中酒醅連續(xù)跟蹤取樣，每個月1個發(fā)酵批次，每次取樣量為1 500 g，樣品混勻后采用封口塑料袋密封后置于4 ℃冰箱或冰柜中冷藏備用，冷藏時間不超過1周，且用于微生物平板計(jì)數(shù)的樣品為當(dāng)天采集的樣品。

1.1.2 主要試劑及儀器

蛋白胨、酵母浸粉、無水葡萄糖、牛肉浸膏、乙酸鈉、吐溫-80、瓊脂粉、MgSO4、MnSO4、CuSO4、酒石酸鉀鈉、NaOH、次甲基藍(lán)、亞鐵氰化鉀等，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑(北京)有限公司。

恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；凱氏定氮儀，丹麥FOSS公司；便攜式酒精度密度計(jì)，奧地利安東帕公司；氣相色譜儀，美國安捷倫公司；精密pH計(jì)，美國Mettle-Toledo公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母總數(shù)計(jì)數(shù)培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉10，葡萄糖20，蛋白胨20，瓊脂粉20，青霉素0.5，1×105Pa滅菌30 min。

細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉浸膏10，酵母浸粉5，葡萄糖5，乙酸鈉5。檸檬酸二銨2，MnSO4·7H2O 0.05，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO42，瓊脂20，吐溫80體積分?jǐn)?shù)0.1%，pH 6.8，1×105Pa滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 微生物總數(shù)平板計(jì)數(shù)

稱取10 g酒醅，置于含90 mL無菌水的三角瓶中，加入玻璃珠，搖床150 r/min振蕩30 min，使酒醅與水充分混合，吸取1 mL菌懸液進(jìn)行梯度稀釋后，取200 μL進(jìn)行平板涂布，其中細(xì)菌計(jì)數(shù)采用傾注倒平板法。酵母和細(xì)菌分別放置于30和37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)2～3 d后，采用菌落記號方式進(jìn)行酵母和細(xì)菌單菌落數(shù)的統(tǒng)計(jì)。

1.2.2 酒醅理化指標(biāo)的檢測

利用常規(guī)方法分析檢測酒醅中水分、酸度、淀粉、還原糖、氨基酸態(tài)氮和粗蛋白，具體步驟參照文獻(xiàn)[26]。

1.2.3 酒醅風(fēng)味物質(zhì)分析

稱取1 000 g酒醅于磨口三角瓶內(nèi)，模擬車間水蒸氣蒸餾收集前段100 mL餾出液進(jìn)行分析，溜出液用便攜式密度計(jì)測定酒精度數(shù)，利用氣相色譜儀檢測微量成分組成及含量。氣相色譜具體方法見文獻(xiàn)[27]。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對酒醅微生物總數(shù)與各理化指標(biāo)、風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，|r| >0.7 且P<0.05 代表高度顯著性相關(guān)。為了揭示不同時期酒質(zhì)整體的變化，采用R語言中Vegen模塊[28]對不同批次酒醅風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了主成分分析。同時對環(huán)境因子、酒醅微生物和酒醅風(fēng)味物質(zhì)之間相關(guān)性進(jìn)行了冗余分析，并進(jìn)了蒙特卡洛置換檢驗(yàn)，以解釋環(huán)境因子對酒醅發(fā)酵過程中微生物的影響以及環(huán)境因素、酒醅發(fā)酵過程中微生物對風(fēng)味物質(zhì)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅發(fā)酵過程中酵母和細(xì)菌總數(shù)的動態(tài)變化

酒醅發(fā)酵過程中酵母總數(shù)的動態(tài)變化見圖1，酵母總數(shù)在整個發(fā)酵過程中呈先上升后下降的趨勢。在發(fā)酵2～4 d，酵母數(shù)量達(dá)到峰值，最高為108CFU/g酒醅。發(fā)酵前期由于霉菌的糖化作用，使淀粉轉(zhuǎn)換為大量能被酵母利用的糖類，所以酵母繁殖較快；發(fā)酵中后期，由于氧氣的消耗和營養(yǎng)物質(zhì)的降低，酵母的生長繁殖受限制，數(shù)量逐漸降低，最后穩(wěn)定在106CFU/g酒醅。

圖1 酒醅發(fā)酵過程中酵母的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic change of yeast number in fermented grains

前期研究發(fā)現(xiàn)，清香型小曲白酒發(fā)酵過程中乳酸菌為主要的優(yōu)勢菌，酒醅發(fā)酵中后期乳酸菌占了90%[4]，故本次細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)以乳酸菌為主。酒醅發(fā)酵過程中細(xì)菌總數(shù)的動態(tài)變化如圖2所示，發(fā)酵前期細(xì)菌總數(shù)進(jìn)入一個遲滯期，發(fā)酵中后期才呈緩慢上升趨勢。這是由于前期酒醅溫度過低，加之酵母的快速增殖，細(xì)菌生長繁殖停緩；發(fā)酵中后期，溫度上升，此時還原糖被酵母大量消耗，滲透壓下降，加上酵母數(shù)量的減少，使釀造環(huán)境適宜細(xì)菌快速繁殖，所以細(xì)菌總數(shù)快速上升，最后穩(wěn)定在107CFU/g酒醅。

圖2 酒醅發(fā)酵過程中細(xì)菌的動態(tài)變化Fig.2 Dynamic change of bacteria number in fermented grains

2.2 酒醅發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化

酒醅中水分不足會影響微生物生長發(fā)酵，降低出酒率；水分過多致使細(xì)菌生長旺盛從而使酒醅易酸化，影響酒質(zhì)，因此要合理的控制酒醅中的含水量。由圖3可知，發(fā)酵過程中酒醅的含水量整體呈現(xiàn)上升趨勢，水分在60%～75%。發(fā)酵0～4 d酒醅水分上升較快，發(fā)酵4 d后水分上升緩慢，逐步至一個穩(wěn)定的狀態(tài)。酒醅中水分的增加可能與酒醅中淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)在微生物作用下逐步代謝為醇、醛、酸、酯等小分子物質(zhì)，在各種生理生化反應(yīng)中，同時產(chǎn)生大量的水分[29]有關(guān)。

圖3 酒醅發(fā)酵過程中水分的動態(tài)變化Fig.3 Dynamic change of water content in fermented grains

酸度是酒醅中所有酸性成分的總量，一定程度上反映了酒醅微生物生長代謝的變化情況。酒醅中的酸度不僅能夠影響微生物的生長代謝，還是白酒中主要的呈味物質(zhì)和香氣成分的前體物質(zhì)。適宜的酸度有利于酒醅糊化、糖化作用，還可以抑制有害微生物的污染[19]。如圖4可知，發(fā)酵過程中酸度的變化呈整體緩慢上升的趨勢，酸度在0.4～1 g/L。發(fā)酵前期，上升較緩慢；發(fā)酵中后期，相對平穩(wěn)；發(fā)酵后期，酸度上升較快，這可能與中后期產(chǎn)酸細(xì)菌生長繁殖較活躍有關(guān)。

蛋白質(zhì)是白酒生產(chǎn)過程中微生物必需的氮源，其水解產(chǎn)物游離氨基酸是酵母生長、繁殖的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，同時游離氨基酸與糖發(fā)生的美拉德反應(yīng)是谷氨酸等眾多香味成分的前驅(qū)物質(zhì)，對后期白酒品種、產(chǎn)量和質(zhì)量有很大影響。菌體在生長過程中菌體蛋白水解為氨基酸和氨態(tài)氮(結(jié)構(gòu)氨基酸在酵母等菌體生長發(fā)酵后期，由于原料減少，部分自溶、自發(fā)酵，釋放成為游離氨態(tài)氮)，成為入窖發(fā)酵風(fēng)味成香物質(zhì)的前趨物質(zhì)或本身就是呈香呈味物質(zhì)。但是過量的蛋白所產(chǎn)生氨基酸便會提高酒體中高級醇的含量[30]。

圖4 酒醅發(fā)酵過程中酸度的動態(tài)變化Fig.4 Dynamic change of acidity in fermented grains

由圖5可知，酒醅發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮呈先下降后上升的趨勢，發(fā)酵0～3 d氨基酸態(tài)氮呈下降趨勢，這與此時期酵母快速增殖、以氨基酸態(tài)為氮源消耗氨基酸態(tài)氮有關(guān)。發(fā)酵3 d后酵母數(shù)量下降，此時氨基酸態(tài)氮含量逐漸穩(wěn)步上升，酒醅中氨基酸態(tài)氮含量大都在0.2～0.8 g/kg。由圖6可知，酒醅發(fā)酵過程中粗蛋白呈逐步上升的趨勢，粗蛋白含量絕大部分在15%～30%。其中發(fā)酵0～3 d，酒醅中粗蛋白含量快速增加，發(fā)酵3 d后，粗蛋白處于一個平穩(wěn)的狀態(tài)，波動不大。

圖5 酒醅發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮的動態(tài)變化Fig.5 Change of amino acid nitrogen in fermented grains

圖6 酒醅發(fā)酵過程中粗蛋白的動態(tài)變化Fig.6 Change of crude protein in fermented grains

酒醅中微生物代謝產(chǎn)生酒精需要有足夠的淀粉轉(zhuǎn)化成微生物可以直接利用的碳源，因此淀粉含量是酒精發(fā)酵的物質(zhì)基礎(chǔ)。淀粉糖化和發(fā)酵速度保持在相對平衡的狀態(tài)，才能夠保證酒醅發(fā)酵正常進(jìn)行。由圖7可知，不同時期淀粉含量變化一致，均是呈逐漸降低的趨勢。其中酒醅發(fā)酵前期(發(fā)酵前3～4 d)淀粉含量迅速下降，發(fā)酵中后期淀粉含量呈緩慢下降趨勢。發(fā)酵前期酒醅中含氧量較多，霉菌分泌的酶類將淀粉轉(zhuǎn)化為酵母可以利用的還原糖類，為酵母的快速增殖提供碳源，從而使淀粉含量快速下降。發(fā)酵中后期，酒醅中乙醇濃度和酸度的增加，會影響微生物的生長代謝，從而使淀粉消耗速度變得逐步平緩。

圖7 酒醅發(fā)酵過程中殘余淀粉的動態(tài)變化Fig.7 Change of starch content in fermented grains

酒醅中還原糖由淀粉酶水解淀粉而生成，還原糖既可以為微生物的生長提供能量，同時又被酵母利用生成酒精，酒醅中還原糖濃度的變化，一定程度上反映了糖化與發(fā)酵速度的平衡和協(xié)調(diào)關(guān)系。酒醅中殘?zhí)呛康亩嗌?，直接反映窖?nèi)酒醅發(fā)酵正常與否[18]。酒醅中還原糖含量變化見圖8，還原糖在發(fā)酵1 d時達(dá)到最大，這是由于淀粉酶水解淀粉產(chǎn)生大量的還原糖，而此時酵母數(shù)量還未快速增加，所以還原糖含量有所積累。隨著酵母數(shù)量的快速增加，需要還原糖作為碳源生長，故發(fā)酵1～3 d還原糖含量快速降低。發(fā)酵中后期由于酵母數(shù)量較少，加上酒醅中環(huán)境的變化，使還原糖含量的降幅逐漸趨于穩(wěn)定。

圖8 酒醅發(fā)酵過程中還原糖的動態(tài)變化Fig.8 Change of reducing sugar in fermented grains

2.3 酒醅發(fā)酵過程中主要風(fēng)味物質(zhì)的變化

酒醅中的酒精含量是微生物代謝產(chǎn)生的，由圖9可知，整個發(fā)酵過程酒醅中的酒精含量是逐漸增加的。發(fā)酵0～1 d增幅較小，發(fā)酵1～3 d快速增加；隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵中后期酒精含量增幅較少，逐漸趨于平穩(wěn)。且酒醅中酒精含量最高不超過60% vol。發(fā)酵前期由于氧氣的大量存在，導(dǎo)致酵母以生長繁殖為主，故酒精含量較低；發(fā)酵中后期，由于氧氣的消耗，酵母以無氧呼吸為主，產(chǎn)生大量的酒精。

圖9 酒醅發(fā)酵過程中酒精含量的動態(tài)變化Fig.9 Change of alcohol content in fermented grains

白酒中雜醇油(異丁醇和異戊醇的總和)主要是在酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生的，雜醇油含量過高會對人體造成傷害，還給酒的風(fēng)味帶來邪雜味，它是中國白酒苦味或澀味的主要來源之一，亦是造成我國白酒出現(xiàn)白色渾濁的原因之一[21]。正是由于雜醇油是酵母代謝產(chǎn)乙醇的副產(chǎn)物，故酒醅中雜醇油含量的變化與酒精含量變化基本保持一致。如圖10所示，雜醇油含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行呈逐漸增大的趨勢，發(fā)酵前期增長較快，發(fā)酵中后期趨于平緩，變化幅度不大。

圖10 酒醅發(fā)酵過程中雜醇油含量的動態(tài)變化Fig.10 Change of fusel oils content in fermented grains

乙醛是酵母乙醇發(fā)酵的中間產(chǎn)物，其含量的變化主要與酵母菌種類和發(fā)酵條件相關(guān)。適量乙醛可能成為構(gòu)成白酒香氣的成分，但超過一定數(shù)量也會使白酒綜合品質(zhì)下降，同時可能有對人體害[31]。由圖11可知，酒醅發(fā)酵過程中乙醛呈先增加后下降最后趨于穩(wěn)定的趨勢。發(fā)酵前期，乙醛含量迅速升高，這與酵母快速生長有關(guān)。發(fā)酵中期，酵母數(shù)量快速下降，導(dǎo)致乙醛含量迅速下降。發(fā)酵末期，此時酒醅中含糖量趨于零，酵母數(shù)量緩慢降低到達(dá)平穩(wěn)期，致使乙醛含量緩慢降低。

圖11 酒醅發(fā)酵過程中乙醛含量的動態(tài)變化Fig.11 Change of acetaldehyde content in fermented grains

乙酸乙酯是清香型小曲白酒的主體香氣成分，其含量高低很大程度決定著清香型白酒的質(zhì)量及風(fēng)格。酒醅中乙酸乙酯含量變化呈逐步累積增加的趨勢(圖12)，發(fā)酵前期增加較快，發(fā)酵中后期趨于穩(wěn)定。說明乙酸乙酯的合成代謝，在發(fā)酵初期已經(jīng)開始，隨著乙醇與乙酸的積累，合成代謝速率有所增加。發(fā)酵中后期由于酯的分解作用，導(dǎo)致了酒醅中積累乙酸乙酯的速率下降，所以發(fā)酵中后期，乙酸乙酯含量趨于穩(wěn)定。

圖12 酒醅發(fā)酵過程中乙酸乙酯含量的動態(tài)變化Fig.12 Change of ethyl acetate content in fermented grains

為了進(jìn)一步解析不同時期酒質(zhì)的變化，本文對不同批次酒醅中的6種主要風(fēng)味物質(zhì)(甲醇、乙醛、正丙醇、乙醇、乙酸乙酯和雜醇油)進(jìn)行了主成分分析。主成分分析結(jié)果顯示2015年和2016年5個批次的酒醅樣品中風(fēng)味物質(zhì)的點(diǎn)并未明顯區(qū)分開來(圖13)，這表明不同時期的不同批次的酒醅風(fēng)味物質(zhì)之間并沒有顯著的差異，可見在小曲清香白酒新工藝條件下，不同時期白酒風(fēng)味物質(zhì)雖然有著波動變化，但仍呈現(xiàn)出相對較為穩(wěn)定的趨勢。而同一批次酒醅隨著微生物發(fā)酵進(jìn)行，其中的風(fēng)味物質(zhì)之間表現(xiàn)顯著的變化。

圖13 不同時期酒醅風(fēng)味物質(zhì)的主成分分析Fig.13 Principal component analysis of flavor in fermented grain of different period

2.4 環(huán)境因素對酒醅發(fā)酵過程中微生物的影響

為了揭示酒醅發(fā)酵過程中影響微生物變化的環(huán)境因素，利用冗余分析(redundancy analysis,RDA)并采用蒙特卡洛對6個環(huán)境因子進(jìn)行了置換檢驗(yàn)。冗余分析結(jié)果顯示環(huán)境因素解釋了酒醅微生物群落動態(tài)變化的32.33%，蒙特卡洛檢驗(yàn)結(jié)果顯示氨基酸態(tài)氮、還原糖、粗蛋白(P<0.01)和水分(P<0.001)是影響酒醅發(fā)酵過程中微生物群落變化重要因素。其中氨基酸態(tài)氮、粗蛋白和水分與細(xì)菌總數(shù)、酵母總數(shù)呈負(fù)相關(guān)，而還原糖與微生物群落呈正相關(guān)(圖14)。

Y-酵母；B-細(xì)菌；R-還原糖；S-淀粉；C-粗蛋白；A-氨基酸態(tài)氮；W-水分；Ac-酸度圖14 酒醅微生物結(jié)構(gòu)和環(huán)境因子之間冗余分析Fig.14 Redundancy analysis of microbes and environmental factors in fermented grain

因此酒醅中氨基酸態(tài)氮、還原糖、粗蛋白和水分變化推動著酒醅中微生物演替。從相關(guān)性分析中也可以看出，酸度對酵母群落變化有著顯著影響，其含量與酒醅中酵母的數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.204，P<0.05)，隨著酒醅中酸度在發(fā)酵后期逐漸上升，會抑制酵母的繁殖，有利于后期酵母將酒醅中糖類轉(zhuǎn)化為酒精(表1)。

表1 環(huán)境因素與酒醅微生物和風(fēng)味物質(zhì)之間的Pearson相關(guān)性Table 1 Pearson correlation between microbes,flavor and environmental factors in fermented grain during fermentation process

注:*:P<0.05，**:P<0.01。

2.5 環(huán)境因素和酒醅微生物對風(fēng)味物質(zhì)的影響

為了解析影響發(fā)酵過程中酒質(zhì)變化的因素，分析了酒醅風(fēng)味物質(zhì)與環(huán)境因子和酒醅微生物的相關(guān)性，Pearson相關(guān)系數(shù)顯示還原糖、淀粉、粗蛋白、氨基酸態(tài)氮和酸度與雜醇油、正丙醇和酒度呈顯著性相關(guān)(P<0.05)，水分與正丙醇和酒度呈顯著性相關(guān)(P<0.05),乙酸乙酯則與淀粉、粗蛋白和氨基酸態(tài)氮顯著相關(guān)，而乙醛和甲醇含量與環(huán)境因子之間相關(guān)性不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在微生物方面，酵母與乙醛、酒度和甲醇之間顯著相關(guān)(P<0.05)，而細(xì)菌與主要的風(fēng)味物質(zhì)含量之間相關(guān)性不顯著。同樣冗余分析結(jié)果顯示環(huán)境和微生物因素共解釋了酒醅風(fēng)味物質(zhì)38.44%的變化。蒙特卡洛檢驗(yàn)結(jié)果顯示水分(P<0.05)、酵母、還原糖(P<0.01)和淀粉(P<0.001)是影響酒醅中風(fēng)味物質(zhì)的重要因素，推動不同發(fā)酵時期風(fēng)味物質(zhì)組成以及含量發(fā)生變化(圖15)。

Y-酵母；B-細(xì)菌；R-還原糖；S-淀粉；C-粗蛋白；A-氨基酸態(tài)氮；W-水分；Ac-酸度；E-乙酸乙酯；F-雜醇油；N-正丙醇；Ace-乙醛；Al-酒度；M-甲醇圖15 酒醅風(fēng)味物質(zhì)與環(huán)境因子和微生物之間冗余分析Fig.15 Redundancy analysis of flavor,microbes and environmental factors in fermented grain

作為白酒微生物重要組成的乳酸菌在分析中并沒有呈現(xiàn)出對風(fēng)味物質(zhì)有重要貢獻(xiàn)。這可能是由于乳酸菌的主要產(chǎn)物—乳酸揮發(fā)性較弱，蒸餾后進(jìn)入白酒中的比例較低，且平板計(jì)數(shù)也存在誤差，因此在本次實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌數(shù)量與酒醅酸度未呈現(xiàn)出顯著性相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

小曲清香型白酒機(jī)械化生產(chǎn)工藝作為白酒生產(chǎn)新工藝，區(qū)別于傳統(tǒng)白酒釀造，實(shí)現(xiàn)了全程機(jī)械化，信息化，現(xiàn)代化，有效地確保釀造工藝穩(wěn)定性。在機(jī)械化白酒釀造中，作為重要催化劑的微生物，處在不同于傳統(tǒng)白酒開放式生產(chǎn)環(huán)境下，群落動態(tài)將會出現(xiàn)其獨(dú)特變化，同樣微生物代謝產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)也隨之形成其特有變化趨勢[11,32]。因此開展釀酒微生物、環(huán)境和白酒風(fēng)味品質(zhì)之間相互作用的研究將有助于解析機(jī)械化白酒生產(chǎn)過程中風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)理。

對2015年和2016年共5個批次酒醅研究顯示不同時期酒醅各項(xiàng)指標(biāo)變化趨勢相似，進(jìn)一步表明了新工藝的相對穩(wěn)定性。冗余分析結(jié)果表明，環(huán)境因素是影響新工藝酒醅中微生物群落變化的重要因素，酒醅中氨基酸態(tài)氮、還原糖、粗蛋白和水分變化推動著酒醅中微生物演替，尤其是在酵母類群的方面。酒醅發(fā)酵過程中還原糖和氨基酸態(tài)氮作為酵母可以利用的碳、氮源，為發(fā)酵前期酵母快速增殖提供了營養(yǎng)物質(zhì)，因此還原糖和氨基酸態(tài)氮在發(fā)酵前期(0～3 d和1～3 d)含量呈現(xiàn)下降趨勢。乳酸菌作為清香型白酒酒醅中優(yōu)勢微生物類群，在發(fā)酵過程中數(shù)量較為穩(wěn)定，可以代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸等，維持酸性釀造環(huán)境，同時為其他發(fā)酵微生物提供了營養(yǎng)物質(zhì)和風(fēng)味化合物的前體物質(zhì)[33]。

環(huán)境因子和微生物是驅(qū)動酒醅風(fēng)味物質(zhì)生成的重要因素[34]。李小龍和王鵬等對濃香型和芝香型白酒發(fā)酵過程中微生物群落演替進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)微生物代謝導(dǎo)致的化學(xué)因素改變是群落演替的關(guān)鍵推動力[7-8]。隨著釀造微生物群落結(jié)構(gòu)改變，其代謝產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)也隨之改變。本研究結(jié)果顯示環(huán)境因子(水分、還原糖和淀粉)和酵母是影響機(jī)械化清香型小曲白酒酒醅中風(fēng)味物質(zhì)的重要因素，推動不同發(fā)酵時期風(fēng)味物質(zhì)組成以及含量發(fā)生變化。清香型小曲白酒釀造過程中，高粱中的淀粉作為微生物代謝的重要底物，被微生物分解轉(zhuǎn)化為還原糖。釀酒酵母和產(chǎn)酯酵母、乳酸菌利用還原糖進(jìn)行增殖與發(fā)酵產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生乙醇、乙酸乙酯等小曲中重要的呈香物質(zhì)[35]。酒醅含水量與各種微生物的生化活動有密切的關(guān)系，含水量促進(jìn)了窖池中微生物的生長、代謝和發(fā)酵，保證了還原糖的有效轉(zhuǎn)化。環(huán)境因素和微生物相互作用形成了清香型小曲原酒獨(dú)特風(fēng)味。在小曲清香白酒新工藝條件下，不同時期的不同批次酒醅中的風(fēng)味物質(zhì)之間雖然有著波動變化，但之間沒有顯著差異，呈現(xiàn)出了與傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)條件下不同的風(fēng)味組成。這表明小曲白酒釀造新工藝在一定程度上擺脫了傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)過多依賴于經(jīng)驗(yàn)的問題，通過機(jī)械智能對釀造環(huán)境因子和微生物群落進(jìn)行調(diào)控，形成穩(wěn)定釀酒生態(tài)微環(huán)境，有助于維持酒體風(fēng)味物質(zhì)穩(wěn)定。

本研究對不同時期清香型小曲白酒新工藝酒醅發(fā)酵過程中的環(huán)境因素、微生物動態(tài)變化和風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律進(jìn)行探討，并利用多元統(tǒng)計(jì)分析方法探究了環(huán)境因素對酒醅微生物以及環(huán)境因素、酒醅微生物對酒醅風(fēng)味物質(zhì)的影響。分析結(jié)果顯示不同時期不同批次的酒醅環(huán)境因子、微生物動態(tài)變化和風(fēng)味物質(zhì)之間并沒有顯著的差異；且環(huán)境因子水分、還原糖和淀粉以及酵母總數(shù)是影響酒醅中風(fēng)味物質(zhì)的重要因素。這對于解析清香型小曲白酒發(fā)酵的機(jī)理以及通過調(diào)整生產(chǎn)參數(shù)提高固態(tài)發(fā)酵過程的可控性具有重要意義。