低聚糖在瑞士乳桿菌和嗜熱鏈球菌冷凍干燥過程中的保護(hù)作用

黃蓉，周子文，莫喬雅，董明盛，芮昕，張秋勤，陳曉紅，李偉

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京，210095)

乳品發(fā)酵劑(culture starter)是一種能夠促進(jìn)乳的酸化過程，含有高濃度乳酸菌的特定微生物培養(yǎng)物。它是用于制造干酪、奶油及發(fā)酵乳制品所用的特定微生物培養(yǎng)材料[1-3]。乳酸菌菌體細(xì)胞和培養(yǎng)基分離是乳產(chǎn)品發(fā)酵劑生產(chǎn)過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，常用的方法有離心分離和超濾分離。離心分離具有方法簡單、處理量大、容易操作等優(yōu)點(diǎn)，是目前工業(yè)上菌體濃縮分離的首選方法。但在離心過程中，菌體不僅受到間隙操作中的氧損傷，還受到剪切力的作用而被拉長，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜的滲透性和抗凍能力下降，因此在實(shí)際操作中常通過添加一定量的離心保護(hù)劑對(duì)乳酸菌菌體進(jìn)行保護(hù)[4-6]。

冷凍干燥(即凍干)是在真空條件下進(jìn)行的使凍結(jié)物料中的固態(tài)水升華從而被除去的一種高效干燥方法，乳酸菌菌體細(xì)胞經(jīng)離心分離后，與凍干保護(hù)介質(zhì)混合，經(jīng)冷凍干燥后可獲得凍干發(fā)酵劑，因此其常用于乳品發(fā)酵劑的工業(yè)化制備。冷凍干燥可以減少菌體細(xì)胞在干燥過程中蛋白質(zhì)失活的可能性，能夠較好保持細(xì)胞原有的構(gòu)架。干燥后發(fā)酵劑呈疏松多孔狀，與水接觸后能夠快速溶解恢復(fù)原來的性狀[7-11]。影響凍干過程中發(fā)酵劑存活率的主要因素有凍干保護(hù)介質(zhì)、凍結(jié)速度和凍結(jié)溫度等。選用合理的保護(hù)措施可以有效地減少菌體在冷凍干燥過程中的損傷和失活，影響乳酸菌凍干效果最突出的就是凍干保護(hù)劑。其不僅有利于提高菌體在冷凍干燥過程中存活率，還會(huì)影響保藏期間發(fā)酵劑的穩(wěn)定性[12-14]。

按分子大小，離心和凍干保護(hù)劑可分為小分子化合物(如低聚糖、醇、緩沖鹽、氨基酸、維生素)和大分子化合物(如蛋白質(zhì)、多肽、多糖)[15-16]。小分子保護(hù)劑(主要是糖類)由于氫鍵的作用具有很強(qiáng)的親水性，可以與菌體細(xì)胞膜磷脂中的磷酸基團(tuán)或菌體蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成氫鍵，既能降低磷脂的轉(zhuǎn)變溫度，也可使磷脂膜之間不致于產(chǎn)生折疊黏連，從而保護(hù)菌體細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的完整性[17-18]。低聚半乳糖和低聚果糖同屬于功能性低聚糖，功能性低聚糖作為被廣泛認(rèn)可的益菌因子在真空冷凍干燥中發(fā)揮著雙重作用，既能使得益生菌維持較高的成活率，也能發(fā)揮促進(jìn)益生菌生長的作用[19]。由于不同的乳酸菌所適用的保護(hù)劑不盡相同，因此需要根據(jù)菌體的自身特點(diǎn)篩選出適合的保護(hù)劑系統(tǒng)。本文在對(duì)分離自新疆傳統(tǒng)食品賽里木酸奶中高產(chǎn)黏瑞士乳桿菌MB2-1(LactobacillushelveticusMB2-1)和嗜熱鏈球菌MB5-1(StreptococcusthermophilusMB5-1)發(fā)酵特性分析的基礎(chǔ)上，通過測定離心和冷凍干燥后菌體的存活率，考察了低聚果糖(fructooligosaccharides,FOS)和低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)在菌體冷凍干燥過程中的保護(hù)作用，這對(duì)乳品發(fā)酵劑的生產(chǎn)及菌種的離心分離和凍干保存均具有一定的理論與實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

LactobacillushelveticusMB2-1、StreptococcusthermophilusMB5-1為本實(shí)驗(yàn)室從新疆拜城縣傳統(tǒng)賽里木酸奶分離和保存，經(jīng)多次傳代遺傳性狀穩(wěn)定[20-21]。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

QHT-90 FOS(純度≥90%)、QHT-600 GOS(純度≥60%),廣東江門量子高科生物股份有限公司；低蛋白乳清粉,法國LACTALIS公司；其他，國產(chǎn)分析純。

80和120 g/L的低蛋白乳清培養(yǎng)基，108 ℃滅菌15 min。

MRS固體培養(yǎng)基[22](g/L)：蛋白胨 10.0，牛肉膏 10.0，酵母膏 5.0，葡萄糖 20.0，吐溫80 1.0 mL，無水乙酸鈉 5.0，檸檬酸三銨 2.0，K2HPO42.0，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.25，蒸餾水 1 L，瓊脂1.5%～2%，pH 6.2～6.6,121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器與設(shè)備

LRH系列生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；Avanti J-E冷凍離心機(jī)，美國Beckman Coulter公司；AIPHAPPHOT-2 YS2光學(xué)顯微鏡，日本Nikon公司；722可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Heto PowerDry LL3000冷凍干燥機(jī)，美國Thermo公司；pH計(jì)，德國Sartorius公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化及發(fā)酵液制備

分別將L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1從甘油管中按4%(體積分?jǐn)?shù))進(jìn)行接種，在37 ℃條件下活化培養(yǎng)12 h，活化2次，培養(yǎng)基使用120 g/L的低蛋白乳清培養(yǎng)基；之后按3%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種到80 g/L低蛋白乳清培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，分別于0、4、8、12、24、48 h取樣測定活菌數(shù)、pH值、滴定酸度、殘?zhí)橇亢途w密度(OD600)數(shù)值。

1.2.2 菌落平板計(jì)數(shù)

用滅菌后的生理鹽水將菌液逐級(jí)稀釋，對(duì)最后3個(gè)稀釋度進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度計(jì)數(shù)2次。吸取1 mL菌液于滅菌平板中，再傾注冷卻至45～50 ℃的MRS固體培養(yǎng)基。最后將平板置于37 ℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.3 細(xì)胞數(shù)量測定

在波長為600 nm條件下，用質(zhì)量濃度80 g/L低蛋白乳清培養(yǎng)基調(diào)零，測量樣液的吸光度。

1.2.4 pH值測定

將pH計(jì)的電極球泡完全浸入樣液，讀取示數(shù)。

1.2.5 滴定酸度測量

將樣液稀釋50倍，加入3～4滴酚酞，用0.05 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定至微紅色，并在30 s內(nèi)不褪色，記錄消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液毫升數(shù)。

1.2.6 殘?zhí)橇繙y量

調(diào)節(jié)分光光度計(jì)波長至490 nm，預(yù)熱30 min。將樣液稀釋100倍，在試管中按次序加入0.5 mL水、0.5 mL稀釋樣液、0.5 mL 6%苯酚、2.5 mL濃硫酸，另取1只試管做空白對(duì)照。

1.2.7 測定離心條件下低聚糖對(duì)菌體的保護(hù)作用

1.2.7.1 離心保護(hù)劑溶液的配制

分別將10、20、30 g的QHT-90 FOS、QHT-600 GOS和葡萄糖溶于100 mL的蒸餾水中,制成質(zhì)量濃度分別為100、200、300 g/L的FOS、GOS和葡萄糖溶液，均在 115 ℃下滅菌15 min待用。

1.2.7.2 離心存活率的測定[15]

將L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1在80 g/L的低蛋白乳清培養(yǎng)基中發(fā)酵12 h后，取10 mL于50 mL離心管中，分別加入40 mL 100、200和300 g/L的FOS和GOS溶液，對(duì)照組加入40 mL的生理鹽水，混合均勻，以4 000×g離心10 min后棄去上清液，各洗滌3次，用生理鹽水復(fù)溶至10 mL，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

離心存活率的測定如公式(1)所示：

(1)

1.2.8 測定凍干條件下低聚糖對(duì)菌體的保護(hù)作用

1.2.8.1 凍干保護(hù)劑溶液的配制

配制方法同1.2.7.1。

1.2.8.2 凍干存活率測定[15]

將L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1在8%的低蛋白乳清培養(yǎng)基中發(fā)酵12 h后，取10 mL于50 mL的離心管中，分別加入40 mL 100、200和300 g/L的FOS和GOS溶液，對(duì)照組加入40 mL的生理鹽水，混合均勻，以4 000×g離心10 min后棄去上清液，再分別加入40 mL相同溶液進(jìn)行復(fù)溶，放入冰柜中預(yù)凍8 h，置于凍干機(jī)內(nèi)凍干48 h，再將其復(fù)溶至10 mL，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

凍干存活率的測定如公式(2)所示：

(2)

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件作圖，SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 L.helveticus MB2-1和S.thermophilus MB5-1發(fā)酵特性分析

由圖1可知，在8 h時(shí)L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1生長緩慢，活菌數(shù)只有0.14×108CFU/mL和0.21×108CFU/mL，在12 h時(shí)活菌數(shù)同時(shí)達(dá)到最大值，分別為8.01×108CFU/mL和7.10×108CFU/mL，24 h后進(jìn)入衰亡期，在48 h時(shí)2種菌的活菌數(shù)分別為1.61×108CFU/mL和2.30×108CFU/mL；OD600值在12 h前增長較快，L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1的OD600值分別從初始時(shí)的0.03和0.04增加至12 h時(shí)的1.89和1.03，之后緩慢增加，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)分別為2.08和1.23；發(fā)酵液的pH值和滴定酸度呈現(xiàn)相反的變化趨勢，在8 h前接種L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1的發(fā)酵液pH值分別從初始時(shí)的6.02和6.00急速下降到4.57和4.62，8 h后pH的變化趨勢逐漸趨于平緩。而接種L.helveticusMB2-1的發(fā)酵液的滴定酸度從0 h的22.50 °T迅速增加到了8 h的最大值，為122.30 °T，接種S.thermophilusMB5-1的發(fā)酵液的滴定酸度則從0 h的20.80 °T迅速增加到了24 h的最大值，為98.20 °T。和LI等[21]使用巴氏滅菌鮮奶培養(yǎng)基相比，發(fā)酵過程中pH值和滴定酸度的變化趨勢相似，但在鮮奶培養(yǎng)基中，pH值于12 h后才逐漸趨于平緩，最低pH值均比低蛋白乳清培養(yǎng)基中低(pH<4)。對(duì)于2種乳酸菌，在整個(gè)發(fā)酵時(shí)間內(nèi)殘?zhí)橇慷汲尸F(xiàn)下降趨勢，在24 h前，殘?zhí)橇繙p少速度較快，24 h以后變化趨勢逐漸趨于平緩，最終在48 h時(shí)L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1的殘?zhí)橇恐挥?.60 g/L和5.30 g/L，說明在整個(gè)發(fā)酵過程中有80%的碳源被充分利用。以上結(jié)果表明L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1兩種乳酸菌均具有較好的底物利用能力和生長情況，可以進(jìn)一步作為乳品等產(chǎn)品的菌種發(fā)酵劑來源。

2.2 不同種類和濃度的低聚糖對(duì)菌體離心的保護(hù)作用

將發(fā)酵12 h的L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1于4 000×g的轉(zhuǎn)速下離心，用不同濃度的GOS、FOS和葡萄糖溶液洗滌3次，空白對(duì)照組用生理鹽水進(jìn)行洗滌，利用平板計(jì)數(shù)法測定菌落數(shù)，結(jié)果如圖2所示。在加入低聚糖保護(hù)劑之后，L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1的活菌數(shù)均與空白樣(生理鹽水清洗)有顯著性差異(P<0.05)，即所選低聚糖保護(hù)劑對(duì)2種乳酸菌均有一定的保護(hù)作用，而葡萄糖組對(duì)菌體的保護(hù)作用不顯著。在同樣濃度條件下，F(xiàn)OS對(duì)乳酸菌的保護(hù)作用要優(yōu)于GOS，且FOS的濃度越高，保護(hù)作用越強(qiáng)。在FOS質(zhì)量濃度分別為200、300 g/L時(shí)，L.helveticusMB2-1的活菌數(shù)分別為5.67×108CFU/mL和5.88×108CFU/mL。因此，選用GOS和FOS作為L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1的離心保護(hù)劑較葡萄糖具有顯著優(yōu)勢，在同濃度下可優(yōu)先選擇FOS作為L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1的離心保護(hù)劑。

圖2 不同濃度的GOS和FOS對(duì)菌體離心后活菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of different concentrations of GOS and FOS on the viable cell counts after centrifugation注：小寫字母表示S.thermophilus MB5-1顯著性差異(P<0.05)；大寫字母表示L.helveticus MB2-1的顯著性差異(P<0.05)。下同。

L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1的菌體存活率見圖3。

圖3 不同濃度的GOS和FOS對(duì)菌體離心后存活率的影響Fig.3 Effect of different concentrations of GOS and FOS on survival rate after centrifugation

結(jié)果表明，不同濃度葡萄糖作為保護(hù)劑時(shí)，對(duì)L.helveticusMB2-1離心保護(hù)作用差異不顯著，菌體的存活率最高為18.73%，以低濃度(100 g/L)GOS和FOS作為保護(hù)劑，對(duì)菌體的保護(hù)作用較低，GOS作用下2株菌存活率分別為38.59%和14.38%，F(xiàn)OS作用下分別為26.62%和14.25%，而提高GOS和FOS濃度，對(duì)菌體的保護(hù)率也相應(yīng)提高，GOS和FOS質(zhì)量濃度300 g/L時(shí)，L.helveticusMB2-1存活率分別達(dá)到68.03%和82.82%；GOS和FOS在相同濃度條件下對(duì)S.thermophilusMB5-1的保護(hù)作用要低于L.helveticusMB2-1，在質(zhì)量濃度300 g/L時(shí)，菌體存活率分別為34.25%和46.00%，對(duì)于2種乳酸菌，相同高濃度(200和300 g/L)條件下，F(xiàn)OS的保護(hù)效果均優(yōu)于GOS。這說明對(duì)于不同類型的乳酸菌，低聚糖的保護(hù)作用具有較大差異，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)不同菌種的特性選擇最優(yōu)的凍干保護(hù)劑以達(dá)到最理想效果。

2.3 不同種類和濃度的低聚糖對(duì)菌體凍干的保護(hù)作用

如圖4所示,與對(duì)離心作用的保護(hù)作用相似，在加入低聚糖凍干后，L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1的活菌數(shù)均與空白樣有顯著性差異(P<0.05)，表明2種低聚糖對(duì)2種乳酸菌均有一定的保護(hù)作用，而葡萄糖組對(duì)菌體的保護(hù)作用較差，在同樣濃度條件下,GOS對(duì)2種乳酸菌的保護(hù)作用要優(yōu)于FOS，且隨著GOS濃度的增加，對(duì)乳酸菌的保護(hù)作用逐漸增強(qiáng)。從圖4中可知，在GOS質(zhì)量濃度分別為200和300 g/L時(shí)，L.helveticusMB2-1的活菌數(shù)分別為4.29×108和5.53×108CFU/mL，而在此濃度下，S.thermophilusMB5-1的活菌數(shù)分別為2.56×108和2.90×108CFU/mL。

圖4 不同濃度的GOS和FOS對(duì)菌體凍干后活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of different concentrations of GOS and FOS on the viable cell counts after freeze drying

GOS和FOS作為凍干保護(hù)劑，L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1的菌體存活率如圖5所示。高濃度的低聚糖保護(hù)作用總體優(yōu)于低濃度低聚糖；凍干條件下，GOS作為保護(hù)劑，菌體存活率要明顯高于同濃度的FOS，對(duì)于L.helveticusMB2-1的保護(hù)作用也要優(yōu)于S.thermophilusMB5-1，在質(zhì)量濃度100 g/L GOS存在的條件下，L.helveticusMB2-1的菌體存活率為46.48%，而在質(zhì)量濃度300 g/L GOS條件下，L.helveticusMB2-1的菌體存活率可達(dá)到77.89%。因此在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，需根據(jù)不同處理步驟、菌種以及生產(chǎn)需要來確定保護(hù)劑的選擇?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)的復(fù)雜性，可以開發(fā)高效復(fù)合保護(hù)劑[23]，以提高應(yīng)用的便利性。關(guān)于低聚糖對(duì)生物分子的保護(hù)作用，目前主要有2種假說解釋低聚糖對(duì)生物分子的穩(wěn)定機(jī)制：第1種為“水替代”假說，該假說認(rèn)為在生物體大分子物質(zhì)的周圍有一層水化層，該水化層是維持生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的必要條件，當(dāng)生物大分子失去這種功能性的水膜時(shí)，低聚糖能在生物大分子的失水部位以氫鍵形式相連接，形成一層類似于水化層的保護(hù)膜以代替失去的水化層；而另一種稱為“玻璃態(tài)”假說，該理論認(rèn)為通過低聚糖玻璃化轉(zhuǎn)變的趨勢，導(dǎo)致了無定形連續(xù)相的形成，在這種結(jié)構(gòu)中分子運(yùn)動(dòng)和分子變性反應(yīng)非常微弱[24-26]。低聚糖在菌體凍干時(shí)的這種保護(hù)作用，為提高工業(yè)化制備發(fā)酵劑的存活率[27-28]提供了一種思路。

圖5 不同濃度的GOS和FOS對(duì)菌體凍干后存活率的影響Fig.5 Effect of different concentrations of GOS and FOS on the survival rate after freeze drying

3 結(jié)論

本研究對(duì)L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1的發(fā)酵特性進(jìn)行了分析，同時(shí)考察了不同濃度的低聚糖對(duì)2種乳酸菌在離心和凍干條件下活菌數(shù)和存活率的影響，結(jié)果表明,L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1兩種乳酸菌均具有較好的底物利用能力和生長情況，可以進(jìn)一步作為乳品等產(chǎn)品的菌種發(fā)酵劑來源；對(duì)于2種乳酸菌，在對(duì)菌體離心的保護(hù)作用中，除100 g/L的低濃度之外，其余濃度下FOS的保護(hù)作用均優(yōu)于GOS，而對(duì)菌體凍干的保護(hù)作用中，GOS的保護(hù)作用均優(yōu)于FOS，這說明不同種類低聚糖發(fā)揮最優(yōu)保護(hù)作用的操作步驟有所不同。2種低聚糖對(duì)L.helveticusMB2-1的保護(hù)作用均優(yōu)于S.thermophilusMB5-1，說明對(duì)于不同類型的乳酸菌，低聚糖的保護(hù)作用具有較大的差異。本實(shí)驗(yàn)為今后更深入地研究低聚糖結(jié)構(gòu)與乳酸菌抗逆境的關(guān)系提供了參考，同時(shí)也為低聚糖作為保護(hù)劑在乳酸菌發(fā)酵劑的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。