拮抗金黃色葡萄球菌的益生菌菌株的篩選及初步研究

鄭佳奇，劉欣宇，佟文英，張?zhí)烊A，崔吉燾，朱燦，孫冶，李新鳴*

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2014級，遼寧 沈陽 110034；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2016級；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室）

益生菌產(chǎn)生抗微生物的物質(zhì)以清除病原菌，阻斷毒素調(diào)控的反應(yīng)，干擾病原性細菌營養(yǎng)的獲取和粘附，并限制病原菌的存在及致病作用［1］。益生菌可以通過增強細胞免疫和體液免疫來調(diào)節(jié)系統(tǒng)免疫應(yīng)答。益生菌的研究多集中在腸道益生菌上，研究最多的是乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬［2］。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），屬于葡萄球菌屬，是人類化膿性細菌感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染［3］。金黃色葡萄球菌是引起醫(yī)院感染的常見病原菌。由于細菌的進化和抗生素的濫用，該菌的耐藥性逐漸增強，特別是甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA）。近年來，MRSA感染的耐藥率和多重耐藥菌株不斷增長，導(dǎo)致臨床抗感染治療難度增加［4］。

目前國內(nèi)外關(guān)于益生菌用于金黃色葡萄球菌感染及耐藥菌株僅僅處于嘗試階段。Howard等［5］首次在實驗外科傷口中用植物乳酸桿菌活菌來預(yù)防金黃色葡萄球菌的感染。國內(nèi)有少量報道乳酸桿菌用于抑制金黃色葡萄球菌生長［6-7］。這也說明了通過微生物干預(yù)金黃色葡萄球菌感染有著光明的前景，但正式應(yīng)用臨床還有待更多的實驗。因此，有必要開展益生菌對金黃色葡萄球菌，特別是對耐藥性金黃色葡萄球菌的拮抗作用研究，可以為臨床有效治療金黃色葡萄球菌感染提供新思路，為微生態(tài)制劑療法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基及試劑 金黃色葡萄球菌（CICC 10201）、銅綠假單胞菌（CICC 10003）、大腸埃希菌（CICC 20152）、植物乳酸桿菌（CICC 21790）（對照菌）購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。MRS培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（BHI）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購于青島海博生物技術(shù)有限公司。TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit購于寶生物工程（大連）有限公司。A549肺癌細胞由病原生物學(xué)教研室保存。MTT試劑盒、細胞培養(yǎng)液等試劑購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 益生菌菌株分離培養(yǎng) 吸取100 μl酸奶原液，用BHI培養(yǎng)基稀釋，制備原液、10倍、50倍、100倍稀釋液。取200 μl稀釋液分別涂布在營養(yǎng)瓊脂平板和MRS平板上，置于37℃溫箱中培養(yǎng)24 h。選擇合適稀釋倍數(shù)的菌液平板，分別選取不同形態(tài)特征菌落計數(shù)。挑取單個菌落分別分段劃線接種于MRS平板，37℃溫箱中培養(yǎng)24 h。對獲得的不同分離株的純培養(yǎng)物置于含30%甘油的BHI培養(yǎng)基中，-20℃凍存保存。

1.3 初步篩選對金黃色葡萄球菌有抑制作用的益生菌菌株 采用牛津杯法［8］，對分離培養(yǎng)獲得的39株分離株進行致病菌拮抗試驗。金黃色葡萄球菌接種于BHI培養(yǎng)基，放入搖床37℃過夜培養(yǎng)后，用新鮮BHI培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌液濃度為108～109個/ml種子液備用。益生菌分離株分別挑取1～2個單菌落放入5 ml BHI培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)18 h，制成種子液。取金黃色葡萄球菌種子液1∶30倍稀釋，稀釋混勻后吸取150 μl加入到營養(yǎng)瓊脂平板上，用涂布棒均勻涂布。將滅菌的牛津杯放置在涂布后的營養(yǎng)平板上，向牛津杯內(nèi)加入培養(yǎng)的乳酸桿菌種子液200 μl；取等體積BHI培養(yǎng)基作為陰性對照。平板于37℃、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基pH 7.2～7.4、避光培養(yǎng)24 h，測量產(chǎn)生的抑菌環(huán)直徑大小。對有拮抗性的2株分離株（A和B株），按照試劑盒操作說明，提取細菌基因組DNA，PCR擴增16S rDNA片段，由生工生物工程上海（股份）有限公司序列分析，對菌株進行鑒定是否為乳酸桿菌屬。

1.4 搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化 實驗搖瓶培養(yǎng)基本條件：溫度35℃，培養(yǎng)時間36 h，接種量25%，培養(yǎng)基初始pH 5.5。根據(jù)前期實驗初步測定，培養(yǎng)搖瓶裝液量為50 ml培養(yǎng)液/250 ml培養(yǎng)瓶、轉(zhuǎn)速180 r/min，菌量達到最高，所以確定其為培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗的搖瓶裝液量、搖床轉(zhuǎn)速。培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗選擇的因素為拮抗菌株培養(yǎng)溫度、初始pH、接種量、培養(yǎng)時間。

取抑菌效果強的1株乳酸桿菌（B株）接種于MRS培養(yǎng)基，同前面方法制成種子液。將高壓滅菌的BHI液體培養(yǎng)基分裝到多個三角瓶內(nèi)，用鹽酸和氫氧化鈉多次少量加入分裝好的BHI液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值。分別將溫度（℃）設(shè)置為32、35和37℃，初始pH設(shè)置為4、5.5和7，接種量設(shè)置為10%、25%和50%，培養(yǎng)時間設(shè)置為24、36和48 h，進行3水平4因素正交實驗。一共9組實驗，分別按照表1中相應(yīng)的條件接種種子液。

表1 拮抗菌株培養(yǎng)條件因素水平表

1.5 乳酸桿菌對金黃色葡萄球菌的拮抗作用 利用正交實驗選出的最佳培養(yǎng)條件，培養(yǎng)乳酸桿菌B株，以培養(yǎng)原液作為種子液。同時按前面拮抗實驗方法，制備金黃色葡萄球菌稀釋菌液，并加入到營養(yǎng)平板涂布均勻后，將滅菌后的牛津杯放置營養(yǎng)平板上，分別向牛津杯內(nèi)加入培養(yǎng)的乳酸桿菌種子液200 μl，檢測益生菌菌株對金黃色葡萄球菌生長的抑制作用。對照采用BHI培養(yǎng)基、乳酸桿菌A及植物乳酸桿菌，對照菌株種子液制備方法同拮抗初篩實驗。

1.6 細胞毒性試驗 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)A549肺癌細胞，收集對數(shù)期細胞并用培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度后分別加入到96孔板，使每孔終體積為 180 μl，5 000個細胞/孔。培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2溫箱培養(yǎng)至細胞貼壁后，再繼續(xù)培養(yǎng)16 h，至細胞單層鋪滿96板孔底，更換為不含血清的培養(yǎng)液。乳酸桿菌B株按照優(yōu)化培養(yǎng)條件制備菌原液，用無血清細胞培養(yǎng)液按照 104、105、106、107、108、109倍比稀釋原液，分別取100 μl不同濃度梯度的益生菌菌液加入單個培養(yǎng)孔，設(shè)5個重復(fù)孔。培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2溫箱培養(yǎng)16 h。吸取上清液，每孔加入90 μl新鮮培養(yǎng)液，再加入 10 μl MTT 溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS液沖洗2～3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入100 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在490 nm處測量各孔的吸光度值（OD）。實驗中設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、BHI培養(yǎng)基、細胞培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。

2 結(jié)果

2.1 初步篩選出對金黃色葡萄球菌有抑制作用的益生菌菌株 牛津杯法對39株分離株進行拮抗實驗，結(jié)果顯示2株分離株有抑制金黃色葡萄球菌生長的作用，其中1株菌株拮抗作用較強。經(jīng)16S rDNA序列分析均為乳酸桿菌屬。這2株分離益生菌菌株命名為乳酸桿菌A株、乳酸桿菌B株。見表2。

表2 金黃色葡萄球菌拮抗初篩實驗結(jié)果

2.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 按照設(shè)計的正交實驗，對乳酸桿菌B株進行培養(yǎng)優(yōu)化，根據(jù)益生菌活菌計數(shù)的結(jié)果篩取得到最適培養(yǎng)條件為接種量為10%，pH值為5.5，溫度為32℃，培養(yǎng)時間36 h。見表3。

表3 拮抗菌株培養(yǎng)條件正交實驗結(jié)果

2.3 乳酸桿菌對金黃色葡萄球菌的拮抗實驗 利用正交實驗選出的最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)乳酸桿菌B株，測定培養(yǎng)細菌原液對金黃色葡萄球菌的抑制作用。拮抗實驗結(jié)果顯示優(yōu)化培養(yǎng)后的乳酸桿菌B株仍具備較好的抑菌活性，見圖1。

圖1 金黃色葡萄球菌拮抗實驗結(jié)果

2.4 MTT細胞毒性試驗 不同稀釋倍數(shù)的乳酸桿菌B優(yōu)化培養(yǎng)原液與A549細胞共同孵育培養(yǎng)后，進行MTT檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)One way ANOVA分析與對照組比較，不同濃度條件下乳酸桿菌益生菌株對A549細胞增殖無明顯影響（P＞0.05），見圖2。

圖2 乳酸桿菌B株MTT試驗結(jié)果

3 討論

目前耐藥性金黃色葡萄球菌在臨床中發(fā)現(xiàn)病例較多，如甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌對紅霉素類和β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物有較強的耐藥性［9-10］。耐藥性金黃色葡萄球菌致病力更強，而且耐藥機制還未完全明確，為臨床抗生素治療帶來了巨大的困難。因此，如何有效治療金黃色葡萄球菌特別是耐藥菌株引起的感染，是臨床亟待解決的問題。有報道益生菌聯(lián)合應(yīng)用敏感性抗生素可抑制金黃色葡萄球菌生長［11］。使用合適的益生菌可以減輕炎癥，維持腸道內(nèi)微生物平衡，因而抑制病原菌增殖，提高機體免疫力［12］。早期使用乳酸桿菌用于呼吸道機械通氣患者可以有效降低肺炎發(fā)生率［13］。

本實驗獲得乳酸桿菌分離株2株，可抑制金黃色葡萄球菌生長。而且實驗中使用的金黃色葡萄球菌菌株是氯霉素、萬古霉素耐藥菌株。乳酸桿菌菌株B經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)后可在實驗室水平獲得較高活菌量，同時保持較強的抑菌能力。而且優(yōu)化培養(yǎng)的菌株經(jīng)MTT試驗檢測其對A549細胞增殖的影響，結(jié)果顯示不同稀釋梯度的益生菌和對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示從酸奶中分離的乳酸菌菌B株對細胞生長抑制作用。由于其對于細胞無毒性，且來源于乳酸制品，該乳酸桿菌分離株為后續(xù)開展益生菌干預(yù)金黃色葡萄球菌感染提供了基礎(chǔ)。使用腸道益生菌預(yù)防、治療金黃色葡萄球菌感染是新嘗試，可為解決臨床耐藥性問題提供新途徑。

本研究通過乳酸桿菌分離株對金黃色葡萄球菌的抑制作用，為乳酸桿菌預(yù)防、治療金黃色葡萄球菌所致疾病提供了實驗依據(jù)。目前治療金黃色葡萄球菌所致的細菌性腹瀉，益生菌聯(lián)合應(yīng)用抗生素具有良好的治療效果［14］。由于乳酸桿菌屬于人體正常菌群成員，并且乳酸桿菌容易大量培養(yǎng)制備。因此，嘗試使用對乳酸桿菌干預(yù)耐藥性金黃色葡萄球菌，具有良好的應(yīng)用前景。