活體成像技術在NK/T細胞淋巴瘤早期檢測中的應用價值研究

劉凡，趙玉，潘新宇，付瑤，于建渤*

淋巴瘤是一組來源于血液淋巴系統(tǒng)的惡性腫瘤，是世界范圍內十大惡性腫瘤之一，好發(fā)于亞洲、墨西哥及南美洲，男女發(fā)病比率為（3～4）∶1［1-4]。隨著社會發(fā)展和腫瘤流行病學因素的變化，淋巴瘤發(fā)病年齡已呈現(xiàn)明顯年輕化趨勢，發(fā)病率逐年上升，5年生存率不足50%，成為威脅人類生命的一大殺手［5-6]。因此，探索NK/T細胞淋巴瘤早期診斷的新方法，是進一步提高NK/T細胞淋巴瘤患者生存率的關鍵［7-9]。

活體腫瘤動態(tài)監(jiān)測是醫(yī)學研究領域的一項重要內容，自1999年美國哈佛大學WEISSLEDER首次提出分子影像學概念至今，分子影像學在世界范圍內取得了長足發(fā)展，為精準醫(yī)學早期診斷疾病提供了有效技術支持［10-11]。光學分子影像學技術能夠非侵入性、實時監(jiān)測、定量分析腫瘤模型中腫塊的生長、侵襲、轉移，是發(fā)展精準醫(yī)學診療的必然方向［12]。

本研究以NK92-Luc裸鼠移植瘤模型為研究對象，以小動物活體成像儀為輔助手段，監(jiān)測NK/T細胞淋巴瘤動態(tài)生長過程，深化活體成像技術（IVIT）在NK/T細胞淋巴瘤早期研究中的應用。

1 材料與方法

1.1 研究材料 NK92-Luc淋巴瘤細胞株由黑龍江省腫瘤重點防治實驗室提供；SPF級雌性BALB/C-nu裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Gibco公司；重組人白介素2（RH IL-2）購自美國R&D公司；嘌呤霉素培養(yǎng)基購自成都思天德生物科技有限公司；螢火蟲熒光素酶鉀鹽D-Luciferin購自美國Xenogen公司；小動物活體成像儀為Berthold Technology-NightOwl LB983；倒置熒光顯微鏡為尼康TS100-F。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和動物飼養(yǎng) 2015年10月—2016年10月，NK92-Luc細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素、89%的RPMI1640培養(yǎng)基、1.5 μg/ml嘌呤霉素培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SPF級雌性BALB/C-nu裸鼠，體質量8～15 g，4～6周齡，飼養(yǎng)在SPF級超凈層流室，恒溫（24～26 ℃）飼養(yǎng)，墊料、籠具、飼料及飲水均經過高壓滅菌和紫外線照射處理。

1.2.2 構建裸鼠皮下移植瘤模型 取對數(shù)生長期NK92-Luc細胞， 移 入15 ml離心 管離 心（1000 r/min，5 min，r=7 cm），棄上清液，經磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，適量PBS重懸，細胞計數(shù)板計數(shù)，按照1×106個細胞/只接種密度，配置細胞懸液。將裸鼠固定在超凈工作臺中，75%乙醇溶液消毒裸鼠左側季肋皮膚，按照每只100 μl NK92-Luc細胞懸液（含1×106個細胞）的劑量，在3只裸鼠左側季肋皮下接種。實驗重復3次，隔天觀察裸鼠狀態(tài)。

1.2.3 常規(guī)方法觀察腫瘤生長動態(tài) 接種NK92-Luc細胞后，每天觸摸和目測接種部位，待腫塊可觸及時記為腫瘤出現(xiàn)時間。本研究中，接種腫瘤細胞第5天裸鼠均出現(xiàn)局部皮膚凸起、增厚，接種腫瘤細胞第5、8、11天用游標卡尺測量腫瘤最長徑和垂直方向最大橫徑，計算瘤體積（體積=橫徑2×長徑/2），繪制腫瘤生長曲線。

1.2.4 小動物活體光學成像技術監(jiān)測裸鼠腫瘤的生長動態(tài) 接種腫瘤細胞第5、8、11天，通過小動物活體光學成像儀檢測裸鼠皮下移植瘤的生物發(fā)光情況，取3只荷瘤裸鼠（造模和成像監(jiān)測均為相同的3只裸鼠），腹腔注射50 μl D-Luciferin（1 mg/ml），記錄注射熒光素酶底物時間；在注射D-Luciferin第7 分鐘時將裸鼠放入麻醉箱中進行異氟烷吸入性麻醉；在注射D-Luciferin第9 分鐘時將3只裸鼠整齊放入活體成像儀暗箱平臺，調整控制平臺升降至合適視野，開啟激發(fā)光源，采用儀器配備的indigo軟件對圖像和數(shù)據(jù)進行分析處理；在注射D-Luciferin第14分鐘時獲取成像圖片。計算各區(qū)域發(fā)出的光子數(shù)，檢測發(fā)光細胞在活體動物內的靈敏度（參數(shù)：曝光時間5 min/次）。

1.2.5 腫瘤肉眼大體觀察和蘇木素-伊紅（HE）組織形態(tài)學觀察 在實驗完畢后，采用斷頸法處死裸鼠，剔除腫塊，行肉眼觀察，并快速用微量天平稱重。腫瘤組織切小塊，置于10%中性甲醛溶液中，石蠟包埋切片，HE染色，電鏡下觀察。具體步驟如下：60 ℃烤片40 min；二甲苯脫蠟2次，5 min/次；酒精梯度脫水（依次為100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%、85%、75%，各3 min），自來水沖洗；浸入蘇木素液染色5 min，自來水沖洗；1%鹽酸酒精分化30 s；自來水沖洗，靜置顯藍10 min；HE染色3 min，自來水沖洗；酒精梯度脫水（依次為75%、85%、95%、100%Ⅱ、100%Ⅰ，各3 min）；二甲苯透明2次，5 min/次；中性樹膠封片。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NK92-Luc細胞培養(yǎng)和形態(tài)學觀察 在顯微鏡下，NK92-Luc細胞在培養(yǎng)基中懸浮生長，成簇生長，細胞呈圓形、類圓形（見圖1）。

圖1 普通顯微鏡下NK92-Luc淋巴瘤細胞形態(tài)Figure 1 Observation of NK92-Luc cell lymphoma morphology under ordinary microscope

圖2 裸鼠移植瘤模型腫瘤生長曲線Figure 2 Tumor growth curve of the nude mouse model of subcutaneous xenograft tumor

2.2 常規(guī)方法觀察腫瘤的生長動態(tài) 在接種瘤細胞第5、8、11天腫瘤體積分別為（0.0038±0.0023）、（0.1323±0.0607）、（0.4232±0.0696）mm3； 根據(jù)3只裸鼠平均腫瘤體積繪制腫瘤生長曲線，腫瘤體積在前2 d增長不明顯，在第3～5天增長明顯加快，在第6～8天增長速度最快，在第9～11天增長趨向緩和（見圖2）。

2.3 IVIT成像 在接種腫瘤細胞第5天，生物發(fā)光成像已經可以檢測到裸鼠皮下腫瘤細胞生物發(fā)光信號。隨著接種時間延長，皮下移植瘤體積及其生物發(fā)光信號逐漸增強，肉眼可見每只裸鼠左側季肋部接種腫瘤細胞部位發(fā)出明亮熒光，隨著時間變化腫瘤逐漸增大（見圖3）。第5、8、11天腫瘤平均實測光子數(shù)為（53688222±25446363）、（2072443366±1029688415）、（5559915605±708457376） ph/s；根據(jù)小動物活體成像儀成像時生物發(fā)光光子數(shù)繪制曲線，其與腫瘤生長曲線的變化趨勢一致（見圖4）。

2.4 剝除腫瘤肉眼大體觀察 裸鼠在接種瘤細胞后第4～5天均能成瘤。腫瘤重量為（0.5020±0.0894） g；肉眼觀，在裸鼠局部皮下可見移植瘤為圓形或類圓形腫塊，剝除腫瘤可見腫瘤外周有纖維組織包繞，切面呈灰紅、灰白色，魚肉狀，質嫩較脆，易出血（見圖5）。

2.5 HE染色組織形態(tài)學觀察 HE染色光鏡下見腫瘤周圍由纖維組織包繞，腫瘤細胞排列成片狀或巢狀，可見腫瘤細胞浸潤血管現(xiàn)象，有不同程度的凝固性壞死；伴不同程度的炎性細胞浸潤，如淋巴細胞、漿細胞及嗜酸粒細胞等；瘤細胞大小不一，核型不規(guī)則，胞漿中等量，可見病理性核分裂象（見圖6A）；肝臟失去正常組織形態(tài)，伴隨腫瘤細胞浸潤（見圖6B）。

3 討論

圖3 裸鼠移植瘤模型IVIT成像Figure 3 IVIT imaging of nude mouse model of subcutaneous xenograft tumor

圖4 接種腫瘤細胞后不同時間點生物發(fā)光光子數(shù)曲線Figure 4 Curve of number of bioluminescent photons at different time points after inoculation of tumor cells

圖5 肉眼觀察3只裸鼠腫瘤形態(tài)變化Figure 5 Naked-eye observation of tumor morphological changes in three nude mice

圖6 裸鼠腫瘤組織和肝臟病理組織學表現(xiàn)（HE染色，×200）Figure 6 Tumor and liver histopathological findings of the nude mouse

近年來，IVIT在腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉移及基因治療等領域備受研究者關注。與傳統(tǒng)腫瘤診療技術相比，IVIT具有傳統(tǒng)技術不可比擬的優(yōu)勢，能夠無創(chuàng)、連續(xù)、動態(tài)監(jiān)測腫瘤的生長變化，為研究腫瘤相關的動物實驗提供科學依據(jù)［13-14]。目前，建立人類裸鼠腫瘤移植瘤模型是現(xiàn)今生物醫(yī)學轉化研究的重要工具，通過模擬人體環(huán)境，借助活體生物發(fā)光成像系統(tǒng)可直觀、連續(xù)、敏感地對腫瘤進行動態(tài)可視化觀察，指導醫(yī)生制定最適診療方案［15-16]。鑒于腫瘤細胞本身無光學特性，因此，通過能發(fā)光且可檢測的生物源性熒光——Luc基因標記腫瘤細胞，使腫瘤細胞攜帶可發(fā)光的Luc基因，隨后將該類具備發(fā)光性能的細胞接種于裸鼠皮下，在裸鼠腹腔注射熒光素酶底物后，即可通過小動物活體成像儀中靈敏的CCD相機設備定量檢測體內所發(fā)射的光子數(shù)量并最終轉換為人類肉眼可見圖像，達到連續(xù)動態(tài)觀測腫瘤生長變化的目的。

本研究首先常規(guī)培養(yǎng)NK92-Luc細胞，在顯微鏡下，可見NK92-Luc細胞在培養(yǎng)基中呈懸浮、成簇狀生長，細胞形態(tài)為圓形、類圓形，生長情況較好。隨后，成功建立裸鼠皮下NK/T細胞淋巴瘤移植瘤模型。這與任苑蓉等［17]用于研究人大細胞肺癌而構建的L9981-Luc研究結果相一致。同時，測量第5天、8天、11天荷瘤裸鼠腫瘤體積，結果表明3只裸鼠腫瘤體積在前2 d增長不明顯，在第3～5天腫瘤體積增長明顯加快，在第6～8天腫瘤體積增長速度最快，這表明腫瘤細胞進入裸鼠皮下后可迅速擴增。在腫瘤細胞注射至裸鼠皮下第5天，通過小動物活體成像儀觀測到腫瘤部位較強的熒光信號，熒光信號越強反映腫瘤細胞數(shù)量越多，也代表腫瘤體積越大，結果顯示，腫瘤部位熒光信號強度隨天數(shù)增加而增強。根據(jù)小動物活體成像儀成像時生物發(fā)光光子數(shù)繪制的曲線，與腫瘤生長曲線變化趨勢一致，證明本研究使用無創(chuàng)技術，達到了連續(xù)示蹤裸鼠體內腫瘤變化的目的。這說明小動物活體成像儀可成功監(jiān)測裸鼠皮下移植瘤模型的演進過程，可為腫瘤體內生長、轉移等研究提供無創(chuàng)、定量示蹤手段［18-19]。

綜上，本研究以NK92-Luc細胞、裸鼠皮下移植瘤模型為研究對象，成功構建NK/T細胞淋巴瘤，通過IVIT動態(tài)觀測并示蹤活體腫瘤，初步探索NK/T細胞淋巴瘤的診斷新方法，具有重要的科學價值和臨床意義。